核酸電気泳動アプリケーション―核酸の分画／精製および核酸解析のための電気泳動

核酸電気泳動の解析アプリケーションは、次の工程に進む前に、これまでの実験結果を確認することができます。この方法は主に目的のバンドの有無や、バンドの濃さ、泳動パターン、移動度、ハイブリダイゼーションなどによって評価します。

核酸の電気泳動は、主に図 1に示したアプリケーションの直後に行われ、実験がうまくいったか、効率はどの程度であるかを判断するために行われています。

• PCR（polymerase chain reaction）は、1 コピーの目的配列を数時間で数百万コピーにまで増幅します。電気泳動はエンドポイント PCR の後、ターゲット遺伝子の増幅とその収量を確認するために行われます。（詳細は、PCR の基礎とアプリケーションを参照）
• 制限酵素反応は、各制限酵素が特定の DNA 配列を認識し切断する反応です。反応後、電気泳動によって DNA の切断パターンが確認できます（また DNA が完全に消化されているか否かも判断できます）（詳細は、制限酵素の基礎とアプリケーションを参照）
• クローニングは、DNA 断片をライゲーション反応によりベクターに組み込む手法です。電気泳動によって、ライゲーション効率を評価することも可能です（図 2）。ライゲーション反応後、E. coli などのコンピテントセルに形質転換し、形成されたコロニー中から、目的遺伝子が組み込まれたベクターを持つクローンをスクリーニングします。通常、コロニースクリーニングでは、PCR や制限酵素処理後、電気泳動でクローンの確認を行います。（詳細は、クローニングの基礎、形質転換の基礎、コロニースクリーニングを参照）
• 逆転写とは、逆転写酵素によって RNA テンプレートに相補的な DNA（cDNA）を合成することです。cDNA を合成し、RNA テンプレートを除去した後、反応効率の評価のために、産物を変性ゲルで電気泳動します。この方法は、既知のサイズの RNA を逆転写する時に最も有効です。（詳細は、逆転写の基礎とアプリケーションを参照）
• In vitro 転写とは、RNA ポリメラーゼによって DNA テンプレートから RNA を合成することです。DNA テンプレートの除去後、合成された RNA を変性ゲル電気泳動によって確認することができます。（詳細は、In vitro 転写の基礎を参照）

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各バンドの核酸量が既知のスタンダードまたはラダーを用いることで、電気泳動は目的の DNA や RNA の定量に利用できます。分光光度法による定量では、ヌクレオチドやプライマー、その他の夾雑物によって正確な定量ができない場合があります。電気泳動はそのような夾雑物から目的のサンプルを分離することができるため、信頼性のある定量法として利用されています。

ゲル電気泳動による定量では、サンプルバンドの強度とラダー中の同等サイズのバンドの強度を比較することによって、サンプルの量を見積もります（図 3A）。より正確に定量するためには、定量用に準備したラダーを、濃度を振って電気泳動し、そのときのアプライ量とバンドの濃さから検量線を作成するのが理想的です（図 3B）。さらには、高感度でダイナミックレンジの広い蛍光標識した核酸を用いれば、ゲル定量はより改善されます。ゲルイメージャーによっては、ゲル定量を簡単に行える解析ソフトウェアが装備されているものもあり、クラウドに接続して、データ保存が可能なものもあります。

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ゲル電気泳動は、サンプルから抽出した後の核酸の純度や完全性だけでなく、断片化が成功したかどうかや、合成した完全長オリゴヌクレオチドの収率などを評価するために使用されます。

• 夾雑 RNA を含むゲノム DNA（およびその逆）は、サンプルの純度を調べるためにゲル電気泳動で分析されます（図 4A）。夾雑物が検出されるかどうかは、夾雑物の量や、使用した核酸染色法の感度に依存します。
• ゲル電気泳動では、抽出後のトータル RNA の完全性を、28S および 18S rRNA の相対比率（分解が全くない RNA の比率は 2：1 です）で、評価することができます。低分子量域のスメアな像は、RNA の分解を示唆しています（図 4B）。
• クロマチン免疫沈降（ChIP）や次世代シーケンシング（NGS）などのアプリケーションでは、サンプル調製で、核酸サンプルの断片化が必要となる場合があります。サンプルの断片化の効率は、ゲル電気泳動によって調べることができます（図 4C）。
• オリゴヌクレオチドでは、合成のカップリング効率が 100％ ではないため、オリゴヌクレオチド産物中には、完全長だけでなく、不完全長配列や欠損配列（n–1 や n–2 など）を含んでいます（詳細は、オリゴヌクレオチドの合成を参照）。電気泳動は、オリゴヌクレオチドのサイズや高次構造の違いから、完全長と欠損配列のオリゴヌクレオチドを区別することができる方法の一つです。

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プローブハイブリダイゼーションによって、核酸プール中のターゲット配列を検出する方法では、電気泳動は重要な工程の 1 つになっています。図 5、6）。プローブは、既知のターゲット配列に特異的に結合するようデザインされた相補配列からなる一本鎖核酸です。

• DNA のフラグメント解析では、サザンブロットと制限酵素断片長多型（RFLP）解析の二つが、電気泳動を利用したターゲットの検出の手法としてよく知られています（図 5）。

• RNA のフラグメント解析では、ノーザンブロットとヌクレアーゼプロテクションアッセイ（NPA）が、プローブハイブリダイゼーションによって目的配列を検出する方法です。ノーザンブロットは、RNA をサンプルとしていますが、操作は、サザンブロットと同様のワークフローで行います（図5）。リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（RPA）では、電気泳動の前に RNA probe をサンプルに添加し、ターゲット配列に結合させます。フリーのプローブやテンプレート、さらに 2 本鎖を形成した RNA 中の 1 本鎖の部分は、RNase A/T1 mix などのリボヌクレアーゼによって消化されます。分解されずに残った 2 本鎖の RNA を電気泳動することによって、ターゲットの検出や解析が行えます。

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電気泳動の留意事項で紹介したように、同じ配列のプラスミド DNA でも、高次構造の違いによって異なる電気泳動移動度を示すことがあります。この性質は DNA の高次構造だけでなく、抽出後のプラスミドの完全性を評価するために使えます。

タンパク質と結合した核酸断片は、単独のときと比べて遅く泳動されます。結合したタンパク質がゲル内での核酸断片の泳動をシフトまたは遅らせるため、電気泳動移動度シフト解析（electrophoretic mobility shift assay：EMSA）と呼ばれています。このような原理に基づく方法は、一般的にゲルシフトまたはゲル遅延アッセイとも呼ばれます（図 7）。そのため、アッセイの電気泳動ステップは、サンプル中のタンパク質に結合した DNA およびフリーの DNA の平衡状態を示す「スナップショット」を提供しているのです。EMSA では、泳動中の核酸―タンパク質複合体の安定性を考慮し、ゲルの調製と電気泳動の両方においてイオン強度の低いバッファーを使用します。 

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電気泳動を用いた核酸の調製法では、電気泳動で分離した後、ゲルマトリックスから核酸を精製します。そのため、電気泳動を介した核酸精製は、ダウンストリームアプリケーションのためのサンプル調製として利用されます。このゲル抽出の手法は、同時に解析を組み合わせて行うこともできます。

電気泳動を用いた核酸精製は、多くの分子生物学テクニックおよびアプリケーション、つまり一般的には、PCR、制限酵素反応、オリゴヌクレオチド合成、断片化、末端修飾、次世代シーケンシング（NGS）のライゲーションステップなどに利用されています。

• PCR 産物や制限酵素消化した DNA は、末端修飾、ライゲーション、クローニング、シーケンシングといったダウンストリームアプリケーションのためにゲルから精製されます。（詳細は、制限酵素クローニング、PCRクローニングを参照）。
• オリゴヌクレオチド合成に伴うポリアクリルアミドゲル電気泳動は、塩類や不完全長の産物を除き、完全長のオリゴヌクレオチドを分離および精製するための最初の方法の 1 つです。
• Illumina や Ion Torrent NGS プラットフォームでは、シーケンシングライブラリの調製の中で、インプットサンプルを断片化後、末端修飾し、アダプターとライゲーションします。これらの工程の後、特定のサイズ幅（例えば、200 ～ 300 bp）の DNA 断片をサイズセレクションと呼ばれる工程で精製し、低分子および高分子の断片やアダプター、酵素、試薬類などを除きます。サイズセレクションは、高品質で再現性の高いシーケンシングを行うために、鎖長のそろった断片からなるインプットサンプルの確保に役立ちます［1］。ゲル電気泳動は、特定のサイズの断片を選択するのに効果的な、サイズセレクションの方法の一つです（図 8）。

結論として、核酸ゲル電気泳動は、幅広い分子生物学的ワークフローやテクニックにおいて、さまざまなアプリケーションに利用されます。電気泳動の基本原理は、1970 年代から変わっていませんが、電気泳動は、核酸の分離解析だけでなく、制限酵素反応から次世代シーケンシングに至る幅広いアプリケーションを支える強力なツールであることが証明されてきました。

1. Head SR, Komori HK, LaMere SA et al.(2014) Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.Biotechniques 56(2):61–4, 66, 68.
2. Moore D, Dowhan, D, Chory J et al.(2002) Isolation and Purification of Large DNA Restriction Fragments from Agarose Gels.In: Ausubel FM et al.(editors) Current Protocols in Molecular Biology.Supplementary 59: Unit 2.6.
3. Gibson JF, Kelso S, Skevington JH (2010) Band-cutting no more: A method for the isolation and purification of target PCR bands from multiplex PCR products using new technology.Mol Phylogenet Evol 56:1126–1128.
4. Chory J, Pllard JD (1999) Resolution and Recovery of Small DNA Fragments.In: Ausubel FM et al.(editors) Current Protocols in Molecular Biology.Supplementary 45: Unit 2.7.