ポジティブセレクションで5分間のクローニング

TOPO® TA Cloning Kit for sequencingは、最大95%の組換え効率を得られる5分のベンチトップ反応によって、Taqを用いて増幅したPCR産物を直接ライゲーションするために、人気のpCR™4-TOPO® TAベクターを利用します。

pCR™4-TOPO®は、致死性のE. coli遺伝子であるccdBが阻害されることで、組換え体を直接選択できます。ベクターにはLacZαフラグメントのC末端と融合したccdB遺伝子が含まれています。PCR産物のライゲーションはlacZα-ccdB遺伝子融合の発現を阻害します。それにより、形質転換してプレートに蒔いたときに、組換えが起こらなかったベクターを含むコンピテントセルは死滅し、ポジティブな組換え体のみが選択的に増殖します。そのため、青/白スクリーニングは必要ありません。

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pCR™4-TOPO® TAベクター-シーケンシング向けに最適化

  • シーケンシングプライマー領域と挿入部位の距離を33 bpまで短縮する最小限のマルチクローニングサイト
  • ポジティブセレクションおよび青/白スクリーニング用のアンピシリンとカナマイシン耐性マーカーおよびLacZα-ccdB遺伝子融合
  • ベクターの短いマルチクローニングサイトにはクローニングされたPCR産物を簡単に切り出すためのEcoRI部位が隣接しており、シーケンシング前のネスティッドデリーションの生成に用いられるユニークなSse8387I部位が含まれています。

pCR™4-TOPO® TAベクター図

pCR™4-TOPO® TAベクター

TOPO TAクローニングの性能と価値

各TOPO® TA Cloning® Kit for sequencingには、直鎖状およびトポイソメラーゼI活性化pCR™4-TOPO® TAベクター、塩類溶液、dNTP、コントロールテンプレートとプライマー、M13フォワードおよびリバースプライマー、One Shot®ケミカルコンピテントまたはElectrocomp™ E. coli、S.O.C.培地、スーパーコイル型のコントロールプラスミドが含まれます。TOPO® TA Cloning® Kitfor sequencing without competent cellsは、コンピテントセルおよびS.O.C. 培地は添付されておらず、ご自身の菌株を使用することで柔軟性を高めることができます。Medium are not provided.

さらに、TOPO® TA Cloning® Kit for sequencing , with One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli, and PureLink™ Quick Plasmid Miniprep Kitはお手持ちのTOPO®クローンインサートでダウンストリーム解析の迅速なプラスミド精製を実現します。

プルーフリーディング酵素をお使いですか？

Platinum® Pfxなど、3´→5´エキソヌクレアーゼ活性がある熱安定性ポリメラーゼには3´ Aオーバーハングがありません。Taqポリメラーゼで生成したPCR産物はTOPO® TAサブクローニングキットでクローニングを高い効率で行いますが、それは3´ Aオーバーハングが削られていないためです。ただし、プルーフリーディングポリメラーゼを使用する場合や平滑末端断片をクローニングしたい場合、PCR反応の最後にTaqとインキュベートすることで3´ Aオーバーハングを付加できます。

または、Zero Blunt® TOPO® PCRクローニングキットを試したい場合もあるかもしれません。これらのキットでは、熱安定性の高いプルーフリーディングポリメラーゼを使って生成した平滑末端PCR産物を迅速に効率よくクローニングすることができます。ccdB遺伝子をポジティブセレクションに利用することも可能です。

注文のご案内

カタログ番号製品詳細添付されるコンピテントセル反応数 
450071TOPO® TA Cloning Kit for Sequencingなし10ご注文はこちら
K4575J10
OPO® TA Cloning® Kit for Sequencing, with One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli
TOP10 (genotype)10ご注文はこちら
450030
TOPO® TA Cloning® Kit for Sequencing, without competent cells
なし25ご注文はこちら
K457501
TOPO® TA Cloning® Kit for Sequencing, with One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli
TOP10 (genotype)25ご注文はこちら
K458001
TOPO® TA Cloning® Kit for Sequencing, with One Shot® TOP10 Electrocomp™ E. coli Electrocompetent TOP10 (genotype)25ご注文はこちら
K459501TOPO® TA Cloning® Kit for Sequencing, with One Shot® MAX Efficiency® DH5α T1 Phage-Resistant Chemically Competent E. coliMAX Efficiency® DH5α (genotype)25ご注文はこちら
K453020
TOPO® TA Cloning® Kit for Sequencing, with One Shot® Mach1™ T1 Phage-Resistant Chemically Competent E. coliMach1™ T1R (genotype)25ご注文はこちら
K457502TOPO® TA Cloning® Kit for Sequencing, with One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli, and PureLink™ Quick Plasmid Miniprep KitTOP10 (genotype)25ご注文はこちら
K457540TOPO® TA Cloning® Kit for Sequencing, with One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coliTOP10 (genotype)50ご注文はこちら
K458040TOPO® TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli Electrocompetent TOP10 (genotype)50ご注文はこちら
K459540TOPO® TA Cloning® Kit for Sequencing, with One Shot® MAX Efficiency® DH5α T1 Phage-Resistant Chemically Competent E. coliMAX Efficiency® DH5α (genotype)50ご注文はこちら

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