介绍

“PhosphoELISA”试剂盒是磷酸化特异性夹心ELISA（酶联免疫吸附测定）试剂盒，可以定量测量细胞内的蛋白质。磷酸化特异性ELISA试剂盒可以在信号研究中用于测量磷酸化、修饰、切割位点特异性和总蛋白。有关更多详情，请访问我们的磷酸化特异性ELISA页面。

快速链接

我们提供各种Thermo Scientific Pierce和Novex磷酸化特异性试剂盒，包括STAT3、CREB、PRAS40、p38、AMPK alpha、PTK2和Caspase 3信号。 这些试剂盒均经过验证并且具有很高的质量和重现性。 这些试剂盒符合灵敏度、动态范围、精密度、特异性、回收率和批次间一致性等质量控制规范。请参见ELISA选择工具部分，找到满足您的研究需求的试剂盒。

ELISA方法是抗原定量的一个基准。ELISA适用于高通量筛选，因为其结果获得快速、一致且相对容易分析。利用高度纯化、预先匹配的捕获和检测抗体，通过夹心方式获得最佳结果。产生的信号可提供非常灵敏且具有高度特异性的数据。

磷酸化特异性方案（图1）始于包被在微孔板孔上的靶蛋白特异性捕获抗体。将样品（包括含有目标蛋白的标准品、对照样品和未知物）移至孔中。在第一次孵育期间，蛋白抗原与捕获抗体结合。洗涤后，向孔中加入检测抗体，该抗体与第一次培养过程中捕获的固定蛋白结合。除去多余的检测抗体后，加入酶联（即辣根过氧化物酶）二次抗体并与检测抗体结合。在第三次孵育和洗涤以除去多余二次级抗体后，加入底物溶液，并通过酶反应转化为可检测的形式（颜色信号）。该有色产物的强度与原始标本中抗原的浓度成正比。Thermo Scientific Pierce和Novex磷酸化特异性试剂盒旨在进行磷酸化特异性检测，具有很高的特异性，并与蛋白免疫印迹数据密切相关。

图 1.典型磷酸化特异性方案我们的即用型磷酸化特异性ELISA试剂盒配有标准品、检测抗体、辣根过氧化物酶偶联物、显色底物和终止液，可完成上述所有步骤。

注释：所提供的方案是多数磷酸化特异性即用型ELISA试剂盒的代表性方案。各个试剂盒的方案可能有所不同。本通用方案可能需要根据目标蛋白、抗体、缓冲液或使用的底物进行优化。有关更多详情，请参见ELISA概述和ELISA开发和优化部分。


材料

典型磷酸化特异性ELISA试剂盒组成部分

  • 抗体包被的96孔微孔板；
  • 检测抗体（有时生物素化）；
  • 标准品
  • HRP偶联物（抗体或链霉亲和素）；
  • 稀释缓冲液；
  • 洗涤缓冲液；
  • 显色底物（即TMB）；
  • 终止液；
  • 孔板盖子；

试验要求的其他材料

  • 细胞提取缓冲液（货号：FNN0011）；
  • 蒸馏水或去离子水；
  • 基于吸光度的微孔板酶标仪；
  • 洗瓶或96孔洗板机；
  • 样品（参见ELISA样品制备方案）。


方案示例

运行时间：4小时— 30分钟手动操作时间。
注释：每次定量分析都必须添加标准曲线。

  1. 使用前，让所有试剂平衡至室温。使用前，轻轻混合所有液体试剂。
  2. 向孔中加入50–100µL制备好的标准品和样品。轻轻敲击孔板的侧面进行彻底混合。盖上孔板，在室温下孵育过夜2小时。

    注释：在细胞提取缓冲液中制备的样品必须使用稀释缓冲液按1:10或更高比例稀释。所选择的稀释度应针对每个实验系统进行优化。

  3.  从孔中彻底吸出或倾倒溶液并丢弃液体。
  4. 使用洗瓶或96孔洗板机清洗孔4次。

    注释：无论您采用何种洗涤方法，(洗瓶或自动洗板机）向孔中注入至少400 µL经稀释的洗涤缓冲液。浸泡15到30秒，然后倒出液体。重复。所有后续洗涤步骤均使用此方法。

  5. 向孔中加入100µL稀释的检测抗体。轻轻敲击孔板的侧面进行彻底混合。盖上孔板，在室温下孵育1小时。
  6. 从孔中彻底吸出或倾倒溶液并丢弃液体。
  7. 洗涤4次。
  8. 向每个孔中加入100µL经稀释的HRP偶联物。盖上孔板，在室温下培养30分钟。
  9. 从孔中彻底吸出或倾倒溶液并丢弃液体。
  10. 洗孔4次。
  11. 向每个孔中加入100µL显色底物。
  12. 在室温下在黑暗中显影30分钟。
  13. 向每个孔中加入100µL终止液。轻轻拍打孔板的一侧进行混合。孔中的溶液应该从蓝色变成黄色。
  14. 必须在反应停止后30分钟内对孔板进行检测。读取每个孔在450和550nm处的吸光度。从450nm的值中减去550nm的值，以校正微孔板中的光学误差。
  15. 使用曲线拟合统计软件计算结果，绘制四参数拟合曲线。

注释：如果使用抗体对试剂盒来构建自己的ELISA，您需要自行将捕获抗体包被在96孔微孔板上。该过程将需要：一个96孔微孔板、捕获抗体和封闭缓冲液（通常是BSA或稀释在PBS中的牛奶）。在开始上述方案之前，请遵循以下步骤：

  1. 使用前，让所有试剂平衡至室温。使用前，轻轻混合所有液体试剂。
  2. 向每个孔中加入100µL经稀释的捕获抗体。盖上孔板，在4℃下过夜孵育。
  3. 将孔板升至室温。从孔中彻底吸出或倾倒溶液并丢弃液体。
  4. 洗孔4次。
  5. 向每个孔中加入200µL封闭缓冲液。盖上孔板，在室温下孵育1小时。
  6. 从孔中彻底吸出或倾倒溶液并丢弃液体。
    --继续上述方案--

特征数据

Thermo Scientific Pierce和Novex磷酸化特异性ELISA试剂盒经过高级测试和验证。以下是通过我们最常卖试剂盒获得的数据。有关我们磷酸化特异性ELISA试剂盒系列产品的更多详情，请访问我们的磷酸化特异性ELISA试剂盒页面。

 
   
图 2.ERK 1/2 [pT185/pY187] 人磷酸化ELISA试剂盒使用上述方案，连续稀释样品，并使用ERK 1/2 [pT185/pY187] 人磷酸化ELISA试剂盒运行方案（货号：KHO0091）运行方案。证明了ERK 1/2标准拼和PMA处理的Jurkat（永生化的人T淋巴细胞）细胞裂解物之间的平行性。
 图 3.PRAS40 [pT246] 人磷酸化-ELISA试剂盒使用上述方案，连续稀释样品，并使用PRAS40 [pT246] 磷酸化ELISA试剂盒（货号：KHO0421）运行方案。证明了PRAS40标准品和Jurkat（永生化人T淋巴细胞）细胞裂解物之间的平行性。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。