贴壁细胞的96孔样本制备

下面介绍的程序描述了一种用贴壁细胞研究信号转导的简便方法（HeLa, MCF-7, BALB/c 3T3, 等）。在这个过程中，将细胞从其培养容器中轻轻提出，放入96孔过滤板的孔中，并根据需要进行刺激。刺激结束时，使用真空管轻轻抽吸，从孔的底部取出细胞培养基。然后用PBS洗涤细胞，抽吸，并通过加入细胞提取缓冲液在孔中裂解细胞。最后使用Invitrogen p38MAPK [pTpY180/182] 和p38MAPK (总) phosphoELISA 试剂盒分析细胞提取物。

需要以下材料:

• 胰蛋白酶/EDTA溶液（货号：25300-054）
• 完整的细胞培养基（如DMEM 加 10% FBS）
• PBS（Invitrogen 货号：11885-076 and 26140-079）
• 细胞提取缓冲液 （货号： FNN0011）
• 圆周板震荡器（Lab Line 板震荡器，货号：4625-EA）
• p38 MAPK [pTpY180/182] phosphoELISA（货号：KHO0061）
• p38 MAPK 总 phosphoELISA（货号：KHO0071）
• Nunc MicroWell 96孔微孔板（货号：167008）
• T75细胞培养瓶（货号：156499）
• 15毫升锥形管（货号：339651）

细胞提取缓冲液配方:

• 10 mM Tris, pH 7.4 • 2 mM Na₃VO₄
• 100 mM NaCl • 1% Triton X-100
• 1 mM EDTA • 10% 丙三醇
• 1 mM EGTA • 0.1% SDS
• 1 mM NaF • 0.5% 脱氧胆酸盐
• 20 mM Na₄P₂O₇ • 1 mM PMSF（0.3 M存储在DMSO中）

制备蛋白酶抑制剂片剂（Sigma货号：P-2714），根据制造商指南，以10倍浓度存储。在每1毫升细胞提取缓冲液添加100微升。

该程序的一般概述参见图 1。

1. 在T75烧瓶中培养细胞至所需的融合度。
2. 轻轻倒出或抽吸培养基。
3. 加入2-3毫升新鲜温热的胰蛋白酶/EDTA溶液。将烧瓶转移到一个37°C的培养箱中。
4. 用温热的PBS清洗。抽吸。
5. 5分钟后，轻敲烧瓶侧面，并在显微镜下检查烧瓶内是否有爬升。如有必要，将细胞再放回培养箱中5-10分钟，偶尔敲击，直到爬升完成。
6. 通过添加5–6毫升完整细胞培养基，快速终止胰蛋白酶反应。
7. 将细胞转移到无菌的15毫升锥形试管中。
8. 以300×g离心7分钟，收集细胞。
9. 倒出上清液。
10. 用移液管将10毫升培养基移至各个锥形试管中，并重新悬浮细胞团块，从而清洗细胞。以300 × g离心7分钟，收集细胞。
11. 将洗涤过的细胞重新悬浮在完整的细胞培养基中。
12. 计数细胞密度。对于大多数应用，细胞密度应调整至5-25 x 10⁴ 细胞/毫升细胞培养基。需要注意的是，这个值可能要求针对每个特定应用进行一些优化。在实验开始时，细胞倍增时间是调整细胞密度时要考虑的一个重要因素。
13. 将200微升细胞培养物（即10000-50000个细胞）放入无菌96孔细胞培养板的孔中。将细胞在37°C孵育18小时。
14. 根据需要刺激细胞。在下面给出的例子中，用100 μM茴香霉素在37°C处理HeLa细胞60分钟。
15. 处理结束时，从孔中吸出培养基。
16. 将200微升冰冷的PBS移至每个孔中，以清洗细胞。通过抽吸移出PBS，重复两次，总共三次洗涤。
17. 吸掉培养基。添加了25微升蛋白酶抑制剂的细胞提取缓冲液移至每个孔中。将板放在冰上培养30分钟。
18. 上下移液5-6次，以彻底混合每个孔中的内容物。对于这种应用，需要用多通道移液器。这个过程导致细胞裂解。此时，已准备好对提取物进行分析。或者，可将提取物储存在 –20°C的过滤板中，以备将来分析。冷冻的板应在冰上解冻，为完成实验做准备。
19. 将板放在一个圆周震荡器上混合1分钟。
20. 准备phosphoELISA 试剂盒。样本孔: 将95微升标准稀释缓冲液（包含在试剂盒中）移至指定用于样本的phosphoELISA板孔中。将5微升细胞提取物从过滤板转移到板的样本孔中。将板放在圆周震荡器上，充分混合孔中的内容物。标准孔: 按照实验方案中的指示准备标准液，并用移液枪转移至指定的孔中。
21. 按照实验方案的指示完成phosphoELISA实验。

图 2显示了用p38 MAPK [pTpY180/182] phosphoELISA（货号：KHO0071）获得的结果。数据表明，茴香霉素处理增加了苏氨酸180和酪氨酸182处p38 MAPK的磷酸化水平，并且这与种入的细胞数量成正比。

在200微升细胞培养基中，以3000、6000和12000个细胞的密度将HeLa细胞种入到板孔中。种入的细胞在37℃孵育18小时，然后用茴香霉素(100μM))处理60分钟，或者不处理。在培养期结束时，用上述方法溶解细胞，并用p38 MAPK [pTpY180/182] phosphoELISA试剂盒进行分析。