96-Well Sample Preparation for Suspension Cells

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介绍

下面介绍的程序描述了用悬浮细胞（Jurkat，Raji，THP-1等）研究信号转导的简便方法。在这个程序中，细胞被放入96孔过滤板的孔中，并根据需要对细胞进行刺激。刺激结束时，使用真空管轻轻抽吸，从孔的底部取出细胞培养基。然后用PBS洗涤细胞，抽吸，并通过加入细胞提取缓冲液在孔中溶解细胞。然后使用Invitrogen™ p38MAPK [pTpY180/182] 和 p38MAPK (总) phosphoELISA™ 试剂盒分析细胞提取物。

材料

材料：
  • 无菌96孔过滤板，1.2微米孔径（Millipore 货号：MSBVS1210）
  • 真空管（Whatman 货号：7705-0102）
  • PBS，冰冷藏（货号：70013-032）
  • 细胞提取缓冲液 （货号： FNN0001）
  • 圆周板震荡器（Lab Line 板震荡器，货号：4625-EA）
  • p38 MAPK [pTpY180/182] phosphoELISA™（货号：KHO0061）
  • p38 MAPK Total phosphoELISA™ （货号：KHO0071）

细胞提取缓冲液配方:
  • 10 mM Tris, pH 7.4
  • 2 mM Na3VO4
  • 100 mM NaCl
  • 1% Triton X-100
  • 1 mM EDTA
  • 10%甘油
  • 1 mM EGTA
  • 0.1% SDS
  • 1 mM NaF
  • 0.5%脱氧胆酸盐
  • 20 mM Na4P2O7
  • 1 mM PMSF (在DMSO中库存0.3 M )

蛋白酶抑制剂片剂（Sigma货号：P-2714），根据制造商指南，以10倍的浓度储存。在每1毫升细胞提取缓冲液添加100微升。

方案

  1. 在T75烧瓶中培养细胞至所需的融合度。

  2. 轻轻倒出或抽吸培养基。

  3. 加入2-3毫升新鲜温热的胰蛋白酶/EDTA溶液。将烧瓶转移到一个37°C的培养箱中。

  4. 用温热的PBS清洗。抽吸。

  5. 5分钟后，轻敲烧瓶侧面，并在显微镜下检查烧瓶，查看爬升。如有必要，将细胞再放回培养箱中5-10分钟，偶尔敲击，直到爬升完成。

  6. 通过添加5–6毫升完整细胞培养基，快速终止胰蛋白酶反应。

  7. 将细胞转移到无菌的15毫升锥形试管中。

  8. 以300×g离心7分钟，收集细胞。

  9. 倒出上清液。

  10. 用移液管将10毫升培养基移至各个锥形试管中，并重新悬浮细胞团块，从而清洗细胞。以300 × g离心7分钟，收集细胞。

  11. 将洗涤过的细胞重新悬浮在完整的细胞培养基中。

  12. 计数细胞密度。建议使用血细胞计数器。对于大多数应用，细胞密度应调整至25–100 x 104 细胞/毫升细胞培养基。需要注意的是，这个值可能要求针对每个特定应用进行一些优化。在实验开始时，细胞倍增时间是调整细胞密度时要考虑的一个重要因素。

  13. 将200微升细胞培养物（即50000–200000个细胞）放入无菌96孔过滤板的孔中。将细胞在37°C孵育24小时。滤板被设计成保留颗粒，同时允许液体从滤板底部流出。

  14. 根据需要刺激细胞。在下面给出的例子中，用20 μg/ml茴香霉素在37°C刺激Jurkat细胞60分钟。

  15. 刺激结束时，将过滤底板放在真空管上，通过轻轻抽吸，从孔底吸出细胞培养基。

  16. 将200微升冰冷的PBS移至每个孔中，以清洗细胞。通过轻轻抽吸，从孔底吸出PBS。重复两次，总共三次洗涤。

  17. 将30微升添加蛋白酶抑制剂的细胞提取缓冲液移至每个孔中。将板放在冰上培养30分钟。

  18. 上下移液5-6次，以彻底混合每个孔中的容纳物。对于这种应用，需要多通道移液器。此时，已准备好对提取物进行分析。或者，可将提取物储存在 –20°C的过滤板中，以备将来分析。冷冻的板应在冰上解冻，为完成实验做准备。

  19. 将板放在一个圆周震荡器上混合1分钟。

  20. 准备phosphoELISA™ 试剂盒。样本孔: 将95微升标准稀释缓冲液（包含在试剂盒中）移至指定用于样本的phosphoELISA™板孔中。将5微升细胞提取物从过滤板转移到板的样本孔中。将板放在圆周震荡器上，充分混合孔中的内容物。

  21. 标准孔: 按照实验方案中的指示准备标准液，并用移液管移至指定的孔中。

  22. 按照实验方案的指示完成phosphoELISA™实验。


结果&讨论

图1中显示的结果是用p38 MAPK [pTpY180/182] phosphoELISA™ （货号：KHO0061）获得的。数据清楚地表明，茴香霉素处理增加了苏氨酸180和酪氨酸182处p38 MAPK的磷酸化水平。图1中显示的数据还显示，用该试剂盒测量的p38 MAPK [pTpY180/182]的量与种入过滤底板孔中的细胞数量成正比。图2中显示的结果是用p38 MAPK Total phosphoELISA™（货号：KHO0071）获得的。该试剂盒旨在使p38 MAPK磷酸化状态正常化。图2中显示的数据表明，茴香霉素处理对细胞裂解物中测定的p38 MAPK总量没有影响，表明茴香霉素通过增强磷酸化状态增加p38 MAPK [pTpY180/182]（图1），而不是改变总p38 MAPK水平。提供的数据还表明，使用该试剂盒测量的总 p38 MAPK 数量与种入过滤底板孔中的细胞数量成正比。



p38 MAPK [pTpY180/182] phosphoELISA™ kit

图1. p38 MAPK [pTpY180/182] phosphoELISA™ 试剂盒。茴香霉素处理的Jurkat细胞增加了p38 MAPK [pTpY180/182]磷酸化水平。

Anisomycin treatment of Jurkat cells
图2. p38 MAPK [pTpY180/182] phosphoELISA™ 试剂盒。Jurkat 细胞的茴香霉素处理不会改变 p38 MAPK（总）表达的水平。


F-1028-BN-pELISA US 1006        2006年6月6日