核提取方案

低渗缓冲溶液

• 20 mM Tris-HCl，pH 7.4
• 10 mM NaCl
• 3 mM MgCl₂
  

磷酸盐缓冲盐水
微量离心管
NP40清洗剂（10%）
Invitrogen™ 细胞提取缓冲液（货号：FNN0011）
PMSF (1 mM)
Sigma蛋白酶抑制剂片剂（货号：P-2714）
Invitrogen™ Quant-iT™ 蛋白检测试剂盒（货号：Q33210）

或者

细胞提取缓冲液配方

• 10 mM Tris, pH 7.4
• 2 mM Na₃VO₄
• 100 mM NaCl
• 1% Triton X-100
• 1 mM EDTA
• 10%甘油
• 1 mM EGTA
•  0.1% SDS
• 1 mM NaF
• 0.5%脱氧胆酸盐
• 20 mM Na₄P₂O₇
  

此细胞提取缓冲液可以在微量离心管中分成1x的等分，使用前在-20℃下储存。提取细胞前先在冰上解冻。

此细胞提取缓冲液必须在使用前补充1 mM PMSF（单独订购）和蛋白酶抑制剂片剂（单独订购），以制成完整的细胞提取缓冲液。抑制细胞提取物中的蛋白水解必须添加蛋白酶抑制剂片剂和PMSF。对于PMSF的添加，我们建议在DMSO中制备0.3 M的储备液，并添加足够的体积以达到1 mM的最终浓度（即每5 ml细胞提取缓冲液17 μl）。PMSF非常不稳定，即使之前添加过，也必须在使用前添加。对于蛋白酶抑制剂片剂的添加，我们推荐采用Sigma（货号：P-2714），根据生产商的说明重新配制，并加入250μl/5ml细胞提取缓冲液。添加蛋白酶抑制剂的细胞提取缓冲液在4℃温度下能够稳定24小时。

本方案已成功应用于若干种人源细胞系。研究人员应该为自己的应用优化细胞提取程序。

  1.   通过离心（非贴壁）或刮取培养瓶（贴壁）收集PBS中的细胞（5 x 10⁶） 。
  2.   用冷PBS清洗细胞两次。
  3.   取出并丢弃上清液，收集细胞团块。
  4.  将细胞转移到预冷却的微量离心管中。
  5.   通过上下移液数次，将细胞轻轻重悬于500 μl 1x低渗缓冲液中。在冰上培养15分钟。
  6.  添加25 μl洗涤剂（10% NP₄0）并在最高设置下涡旋10秒。
  7.   将匀浆在4℃下以3000rpm的转速离心10分钟。
  8.   转移并保存上清液。该上清液含有细胞质部分。团块就是核部分。
  9.   将核团块重新悬浮在50 μl完整的细胞提取 缓冲液中，在冰上放置30分钟，内部涡旋10分钟。
10.  在4℃下以14000 x g离心30分钟。将上清液（核部分）转移到干净的微量离心管中。
11.  等分并储存在-80℃温度下。现在核提取物已准备就绪，可以进行分析了。
12.  使用Quant-iT蛋白测定试剂盒（货号：Q33210）定量蛋白浓度。