细胞提取方案

初生组织是研究表征疾病状态的细胞内和细胞外标记物的有价值的工具。我们开发了一种从完整组织中快速分离细胞因子和信号分子的方案。本方法用于提取总蛋白，并使用非研磨性组织提取试剂。使用本方案可以提取低至10mg的组织样本。此方法灵敏度高，并且能够检测与疾病相关的生物标记波动情况。这是从各种组织类型中提取蛋白的有效系统。已使用本方案成功提取心脏、肺、肾、脾、脑、肝、胸腺和平滑肌组织。制备的提取物适用于多种免疫检测，如ELISA和Invitrogen™ Luminex™平台，以及所有常规的蛋白检测。我们的提取方法价格低廉，用途广泛，可以在15分钟内完成。我们提供细胞提取缓冲液，用于从各种组织样本中提取总蛋白。

使用以下配方制备1x细胞提取缓冲液：

细胞提取缓冲液配方

    * 10 mM Tris, pH 7.4
    * 2 mM Na₃VO₄
    * 100 mM NaCl
    * 1% Thermo Scientific™ Triton™ X-100
    * 1 mM EDTA
    * 10%甘油
    * 1 mM EGTA
    *  0.1% SDS
    * 1 mM NaF
    * 0.5%脱氧胆酸盐
    * 20 mM Na₄P₂O₇


可订购此细胞提取缓冲液———货号：FNN0011。

此细胞提取缓冲液可以在微量离心管中分成1x的等分试样，使用前在-20℃下储存。提取细胞前先在冰上解冻。

需要的其他试剂：

1 mM PMSF
Sigma蛋白酶抑制剂片剂（货号：P-2714）

此细胞提取缓冲液必须在使用前补充1 mM PMSF（单独订购）和蛋白酶抑制剂片剂（单独订购），以制成完整的细胞提取缓冲液。抑制细胞提取物中的蛋白水解必须添加蛋白酶抑制剂片剂和PMSF。对于PMSF的添加，我们建议在DMSO中制备0.3 M的储备液，并添加足够的体积以达到1 mM的终浓度（即每5 ml细胞提取缓冲液17 μl）。PMSF非常不稳定，即使之前添加过，也必须在使用前添加。对于蛋白酶抑制剂片剂的添加，我们推荐采用Sigma（货号：P-2714），根据生产商的说明重新配制，并加入250μl/5ml细胞提取缓冲液。添加蛋白酶抑制剂的细胞提取缓冲液在4℃温度下能够稳定24小时。

1. 在所需的细胞培养时间结束后，将培养基移至微量离心管中并


2. 立即放置在冰上。


3. 以1400 rpm 的速度离心1分钟。


4. 除去上清液，并等分至干净的微量离心管中。


5. 在用于ELISA前，在–80°℃温度下储存。

细胞处理

此方法可用于在所研究的每种刺激方式下产生相对大量的细胞提取物。本程序中的洗涤步骤有助于将细胞提取物中的培养基成分降至最低。

1. 估计细胞密度：悬浮细胞：通过血细胞计数器来计数悬浮细胞。贴壁细胞：在显微镜下通过目测估计细胞密度。研究发现70-80%的汇合水平是很多信号转导研究的最佳水平。


2. 根据需要刺激细胞。


3. 将细胞转移到干净的15 ml 锥形管中：悬浮细胞：将培养基中所需数量的细胞等分到干净的15 ml 锥形管中。贴壁细胞：刮除容器中的细胞。将含有分离细胞的培养基转移到干净的15 ml 锥形管中。


4. 以300 × g离心7分钟，收集细胞。


5. 抽掉培养基。


6. 将团块重新悬浮在冰冷的PBS中。


7. 通过在4℃下以300 × g离心7分钟，收集细胞


8. 抽掉PBS。


9. 通过将完整细胞提取缓冲液移至每个试管中来溶解细胞。我们建议每10⁸个细胞使用1 ml 完整细胞提取缓冲液。需要注意的是，该值可能需要针对每个具体应用进行优化。


10. 将裂解物转移到干净的微量离心管中。


11. 涡旋混匀，然后在冰上培养混合物30分钟，偶尔进行涡旋。


12. 通过在4℃下以14000 rpm（13000 x g）离心10分钟，澄清裂解物。


13. 将澄清的细胞提取物转移到干净的微量离心管中。


14. 在进行分析前，澄清的细胞提取物应储存在-80℃下。避免重复冻融循环。在准备进行检测时，让样品在冰上融化。分析前充分混合。


15. 使用合适的方法测定蛋白浓度，例如Invitrogen™ Quant-iT™蛋白定量试剂盒（分类编号：Q33210）。通过这种方法制备的细胞提取物的蛋白浓度通常在1至10 mg/ml之间。


16. 某些分析物需要进行样品处理步骤。有关样品处理建议的详细信息，请参考具体分析物方案。


17. 在使用Invitrogen™试剂盒进行分析之前，所有细胞提取物都需至少按1:10的比例在标准品稀释缓冲液中稀释。