抗体標識化および固定化部位

抗体は、他のタンパク質と同様に、特定のアッセイの目的に合わせてさまざまな方法で共有結合修飾を施すことができます。多くの免疫学的手法において標識抗体が使用されており、抗体の標識化を可能とする試薬が作製されてきました。酵素、ビオチン、フルオロフォアおよび放射性同位体は、生物学的アッセイにおいて検出シグナルを提供するために一般的に使用されています。

標識化、架橋あるいはは共有結合固定化のいずれであっても、最良の修飾法を選ぶためには、抗体上の利用可能な官能基を把握することが鍵となります。一般的な抗体標識戦略に用いられる標的は以下の3種類のいずれかです：

• 第一級アミン (–NH2): リジン残基上や各ポリペプチド鎖のN末端上に見られます。多量の第一級アミンが、抗体全体に分布しています。
• スルフヒドリル基 (–SH): システイン残基上に見られ、全分子構造を安定化させるジスルフィド結合として存在します。ヒンジ領域のジスルフィドを選択的に還元することによって、標的標識化に遊離スルフヒドリルを使用できるようになります。
• 糖質 (糖鎖): グリコシル化は、主に抗体 (IgG) の Fc 領域で生じます。シス-ジオールを含有するこれらの多糖類部分中の糖質成分を酸化させることにより、結合のための活性アルデヒド (–CHO) を作製できます。

抗体構造および修飾部位

抗体の標識化や結合のための最も一般的な標的は、リジン残基上に見られる第一級アミンです。第一級アミンは、その反応性や、抗体表面に多数存在し、広範に分布していることによって簡単に修飾を施すことができます。

第一級アミンは、さまざまな種類の結合化学の標的にすることができます。N-ヒドロキシサクシニミジルエステル (NHS エステル) 反応基を利用した試薬は、特異性と効率性が最も高くなります。多くのビオチン化製品や蛍光標識製品は、NHS エステル基が予め活性化された形態で市販されています。

西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) やアルカリホスファターゼ (AP) などの酵素に抗体を結合させるには、一般に他のアミンを標的とする戦略 (グルタルアルデヒド法、還元的アミノ化架橋法など) が取られます。Thermo Scientific AminoLink Plus Coupling Resin は、還元的アミノ化により、第一級アミンを介して、抗体を共有結合的に固定化させます。

あらゆる特定の抗体クローンにおいて、抗原結合部位内にリジン (第一級アミン) が生じる可能性があります。つまり、この標識化戦略には、抗体の抗原結合活性は大幅に低減する場合があるという唯一の欠点があります。モノクローナル抗体を扱う場合や、抗体分子当たりの標識が高密度な場合は特に、活性の低減が顕著になる可能性があります。

抗体の共有結合標識用として、2番目に有用な標的は、スルフヒドリルです。スルフヒドリル基は還元条件下のタンパク質中に存在しますが、一般的には、天然タンパク質 (抗体を含む) 中にジスルフィド結合の酸化型 (シスチン) として見られることが多いです。ジスルフィド結合は、重鎖と軽鎖を共有結合により連結させ、さらにヒンジ領域で 2 つの半分の抗体を連結させることで、各サブユニットの三次構造に関与しており、抗体機能に大きく貢献しています。

硫黄原子における結合には、チオールが遊離スルフヒドリル基として存在することが求められます。そのため、抗体を標識するためには少なくとも天然ジスルフィド結合の一部を還元剤で切断する必要があります。ヒンジ領域のジスルフィドは還元に対する感受性が最も高いため、これらのジスルフィドのみを選択的に切断することによって、残存した構造と抗原結合部位を損傷させずに、半分の一価の抗体に分割することができます。

分割が達成できたら、ヒンジ領域のスルフヒドリルで抗体を標識化することで、規定の位置での一貫した標識化を確実に行えるようになります。アミンを標的とした標識法と対照的に、この標識法では、より確実に、抗原結合部位の活性化が維持され、またサンプル中の抗体分子集団に対して一律の密度で標識が施されます。

マレイミド基またはヨードアセチル基で活性化された試薬は、スルフヒドリルへの結合用途に非常に効果的です。多くのビオチン化試薬、蛍光および酵素標識試薬は、マレイミド基が予め活性化された形態で市販されています。Thermo Scientific SulfoLink Coupling Resin は、ヨードアセチル化学を使用し、スルフヒドリル基を介して抗体を固定化させます。

抗体の標識用として、3 番目に有用な標的は、糖鎖です。抗体中のグリコシル化部位は、主に抗体の Fc 部分に見られるため、通常は抗原結合能力に大きな影響を与えずに修飾を施すことができます。

反応性アルデヒドを作製するために最初に糖鎖を酸化させる必要があるため、糖鎖の標識化は、アミンの標識化よりも工程数が多くなります。しかしながら、この戦略では、一般に高活性の抗体コンジュゲートが得られます。

アルデヒド活性化 (酸化) された糖鎖は、(上記の) 還元的アミノ化を介して第一級アミンと、またはヒドラジド基で活性化された試薬と直接反応させることができます。弊社は、数タイプのヒドラジド活性化ビオチン化試薬を取り揃えています。GlycoLink Coupling Resin は、還元的アミノ化を使用し、酸化された糖鎖を介して抗体を固定化させます。この抗体固定化法は、免疫沈降法にも適用できます。