抗体の産生および精製に関する概要

抗原に特異的に結合可能な抗体を産生する動物免疫系の特性を利用して、さまざまな研究や診断の用途における目的分子の検出プローブを作製することができます。研究者自身により設計・製造できる高特異的な分子認識ツールは、現時点では本技術のみです。

分子解析に携わる医学研究者や細胞生物学研究者はほぼ皆何らかの形で抗体技術を利用しています。各人の特定の研究ニーズによって、抗体の産生や精製への研究者による関与程度は異なるでしょう。

抗体は、体内へ侵入する外来分子に反応して、免疫系により産生される宿主タンパク質です。これらの外来分子は抗原と呼ばれ、免疫系がそれらの分子を認識することにより、特異的抗原に結合できる抗体を選択的に産生します。抗体は B リンパ球によって産生され、血液中およびリンパ液中を循環しながら特異的抗原に結合することにより、標的抗原を循環経路から排除します。

抗原に特異的に結合可能な抗体を産生する動物免疫系の特性を利用して、さまざまな研究や診断の用途における目的分子の検出プローブを作製することができます。研究者自身の手で設計や製造が行える技法は、高特異的な分子認識ツールしかありません。高特異性の他にも重要な特性がいくつかあるため、抗体はプローブの開発に特に有用です。例えば、各抗体は、抗原結合決定部位を除いて、比較的均一で、十分に特性決定されたタンパク質構造を共有しているため、一般的手法による予測的かつ再現性の高い抗体の精製、標識および検出が可能です。

抗原特異的プローブとして使用するための抗体を産生、精製および修飾する手法は、1970年代から1980年代に開発されました。そして、今日では著名な「抗体: 実験室マニュアル」 (Harlow 氏、Lane 氏による共著) が 1988 年に出版されて以来、基本的にこの手法は変更されていません。

"抗体産生"という用語には、一般的な意味と特定の意味の2つがあります。広い意味では、使用可能な特異的抗体を作製するための全工程を指します。これには特定の方法で直接使用するための、免疫原の調製、免疫化、ハイブリドーマの作製、回収、スクリーニング、アイソタイピング、精製、および標識が含まれます。限定的な意味での抗体産生とは、抗体生成に至るまでの工程を指します。ただし、特定用途用の抗体の各種精製および標識工程は除外されます。

抗体産生には、抗原サンプルを調製し、それらを実験動物または家畜に安全に注射することにより、血清中で抗原特異的抗体を高レベルで発現させ、それらを動物から回収可能になるまでが含まれます。ポリクローナル抗体は、血清 (出血) から直接回収されます。モノクローナル抗体は、免疫化マウスの抗体分泌脾臓細胞を不死化骨髄腫細胞と融合させて作製した、細胞培養上清中で特異的抗体を発現するモノクローナルハイブリドーマ細胞株によって産生されます。

抗体産生を成功させるには、以下数項目の重要な工程と検討事項に関して綿密な計画を立てることが重要です:

• 標的抗原 (例: ペプチドまたはハプテン) の合成や精製
• 適切な免疫原性キャリアタンパク質の選択
• 免疫原を作製するための抗原とキャリアタンパク質の結合
• 適切なスケジュールとアジュバント組成物による動物免疫化
• 抗体価およびアイソタイプに関する血清 (またはハイブリドーマ) のスクリーニング (「抗体の特性評価」とも言われます; 下記参照)

抗体精製には、血清 (ポリクローナル抗体)、腹水、あるいはハイブリドーマ細胞株の培養上清 (モノクローナル抗体) からの抗体の分離が含まれます。精製方法は、クルード状態 (粗精製) から高度に特異的な精製までのレベルがあります:

• 粗精製—免疫グロブリンを含む総血清タンパク質サブセットを沈殿させます
• 標準精製—抗原特異性に関係なく、特定の抗体クラス (例: IgG) をアフィニティ精製します
• 特異的精製—特定の抗原分子に結合するサンプル中の抗体のみをアフィニティ精製します

使用できる抗体の取得に必要な精製レベルは、意図する抗体の用途に依存します。

抗体の特性評価は、以下の 3 つのプロセスをとります。通常これらのプロセスは、抗体の産生および精製の全過程においてさまざまな段階で実施されます。

• スクリーニング—抗原結合特異性を持つ抗体サンプルの同定
• 力価測定—抗体濃度と機能アッセイ力価の測定
• アイソタイピング—モノクローナル抗体のクラスおよびサブクラスの属性の決定

抗原特異的抗体を高レベルで産生している動物やハイブリドーマのクローンを同定するために、抗体産生プロセスの第一段階にスクリーニングを行う必要があります。スクリーニングには、通常、ELISA 法を適用します。

抗体濃度は、標準タンパク質アッセイまたは特殊なマイクロ凝集アッセイキットなどを用いる種特異的かつ免疫グロブリン特異的な手法のいずれかで推定することができます。抗体価は、濃度に関連しますが、厳密には所定抗体サンプルの有効力価を指しています。一般的に、力価測定とは、ELISAなどの所定アッセイでの検出に必要な抗体サンプルの機能的希釈度を測定することを指します。

アイソタイピングでは、モノクローナル抗体のクラス (例: IgG または IgM) およびサブクラス (例: IgG1 または IgG2a) をそれぞれ決定する必要があります。分子の精製法や修飾法を適切に選ぶうえで必要とされるアイソタイピングは、抗体産生の重要なステップと言えます。市販のすぐに使用可能な抗体アイソタイピングキットを利用すれば、アイソタイピングはごく簡単に実施できます。

精製された抗体は、より小さな抗原結合単位への断片化、酵素や他の検出可能マーカーとの結合、固体担体への固定化といった方法により、特定用途用に修飾することができます。一般的には、全分子型の抗体が使用されています。ただし、非必須部位の除去された抗体を用いれば、一部の手法や実験の性能を向上させることができます。

抗体断片化とは、 抗体分子全体を別個に切断させ、抗原結合に必要のない部位を除去する処理を指しています。Fab および F(ab)'2 は、IgG の抗体断片として、研究者の間では最も頻繁に作製・利用されています。

抗体は、抗原特異的プローブとして使用するために産生・精製されます。しかしながら、所定の手法 (ELISA、ウエスタンブロッティング、細胞イメージング、免疫組織化学) における抗体の有用性は、二次的な抗体検出メカニズムを抗体が有するか否かによって左右されます。

免疫沈降や他のアフィニティー精製で抗体を用いる手法は、クロマトグラフィー媒体 (例: ビーズアガロース樹脂) への結合/固定化メカニズムに依存しています。これを達成させる戦略には、抗体標識化と同様の検討事項や化学的手法が必要とされます。

1. Alberts, B., et al.(1983).Molecular Biology of the Cell.Garland Publishing, Inc., New York, NY.
2. Harlow, E. and Lane, D. (1988).Antibodies: A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
3. Sites, D.P., et al.(1976).Basic&Clinical Immunology.Lange Medical Publication, Los Altos, CA.