架橋の化学

20種類のアミノ酸の組成とシーケンスといったタンパク質構造は複雑であるにもかかわらず、実用的バイオコンジュゲーション法で使用可能な標的を含むタンパク質官能基はごくわずかです。つまり、以下4種類のタンパク質化学的標的で、架橋法および化学修飾法の大半が占められています：

• 第一級アミン（-NH 2）： 各ポリペプチド鎖（別称：アルファアミン）のN末端や、リジン（Lys、K）残基（別称：イプシロンアミン）の側鎖に存在する基です。第一級アミンは生理的条件下で正電荷するため、通常はタンパク質の外側（外表面上）へ面しています。そのため、通常タンパク質構造を変性させずに、結合させることが可能です。
• カルボキシル（-COOH）： 各ポリペプチド鎖のC末端や、アスパラギン酸（Asp、D）およびグルタミン酸（Glu、E）の側鎖に存在する基です。第一級アミンと同様に、カルボニルは通常タンパク質構造の表面に存在します。
• スルフヒドリル（-SH）： システインの側鎖（Cys、C）に存在する基です。一般にシステインは、タンパク質の二次/三次構造の一部として、ジスルフィド結合 (–S–S–)を介して、側鎖間において互いに接合されています。標準的タイプの反応性基による架橋にこれらを使用するには、スルフヒドリルに還元させる必要があります。
• カルボニル（-CHO）： ケトンまたはアルデヒド基は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムで多糖翻訳後修飾（グリコシル化）を酸化させることによって、糖タンパク質中で作製されます。

様々な反応性基が特徴づけられ、主要タイプのタンパク質官能基の標的化に利用されてきました。2種類の架橋試薬の組み合わせが、1分子中に組み込まれる反応性基よりも多い場合、多種多様な架橋試薬を合成させることができます。異なるサイズや化学的「骨格」（各反応性末端間の距離を定義するため、スペーサーアームと呼ばれる）タイプを組み合わせれば、架橋化合物タイプは膨大な数に上ります。

タンパク質結合用の一般的な架橋剤反応基反応性クラスのタイトルをクリックすると、本ページ上の各項リンク先へ移動します。イタリック体表記の化学基名については、本ページで解説をしておりません。

化学的反応性（特定官能基への特異性）や各種アプリケーションでの作用に影響を及ぼす化学的性質に基づいて、架橋剤を選択します：

• 化学的特異性とは、架橋剤の反応性末端の反応標的を指します。一般に、試薬の両末端の各反応性基がお互いに同一か、あるいは異質かどうかを考察します（同一の場合ホモ二官能性、異質の場合ヘテロ二機能性とそれぞれ呼ばれます;下記をご参照ください）。
• スペーサーアーム長 とは、架橋剤の分子スパン（結合分子間の距離）を指します。これに関連して、アームが切断可能であるかどうかを考察します（必要に応じて、結合の可逆性や、結合の切断性を考察）。
• 架橋剤の水溶解性と細胞膜透過性 によって、細胞内への浸透性や、膜内への疎水性タンパク質の架橋能力の有無が左右されます。スペーサーアームや反応性基の組成物に応じて、これらの特性が決定付けられます。
• 架橋剤中の自発的反応性基または光反応性基 によって、サンプル添加後に即座に反応するかどうか、あるいは紫外光への曝露により特定時に活性化できるかどうかが左右されます。

架橋剤は、ホモ二機能性またはヘテロ二機能性に分類できます。

ホモ二機能性架橋剤は、スペーサーアーム両端に同一の反応性基を有しており、一般に官能基などを含有する分子をランダムに「固定化」または重合させるワンステップ反応手順で使用するべきです。例えば細胞溶解物へアミン-アミン架橋剤を添加すると、タンパク質サブユニットがランダムに結合して、タンパク質とポリペプチド（溶液中で各リジン側鎖が偶発的に互いに接近したポリペプチド）が相互作用します。これは、全てのタンパク質相互作用の「スナップショット」の捕捉に非常に適していますが、他タイプの架橋アプリケーションに求められる精度は満たしていません。例えば抗体-酵素複合体を調製する場合、（ひとつまたは複数の）抗体間結合を形成させずに、抗体の各分子へ酵素分子を結合させることを目標にします。ホモ二機能性架橋剤でこれを達成することはできません。

ヘテロ二機能性架橋剤が各末端に有する反応基はそれぞれ異なります。これらの試薬の効力よって、それぞれの標的官能基を有する分子を単一工程で結合させられるだけでなく、望ましくない重合や自己共役を最小限に抑える配列結合（2工程）も可能になります。配列結合手順では、最初に架橋剤の極度の不安定基を用いて、ヘテロ二機能性試薬を一つのタンパク質と反応させます。未反応架橋剤の過剰分を除去した後、架橋剤の第二反応性基を介した反応の発生する第二タンパク質を含有する溶液へ、修飾された第一タンパク質を添加します。一端にアミン反応性スクシンイミジルエステル（NHSエステル）を有し、もう一端にスルフヒドリル反応性基（例：マレイミドなど）を有するタイプのヘテロ二機能性架橋剤が一般的に利用されています。NHSエステル基は、水溶液中で安定性が低いため、通常は最初にタンパク質に反応させます。第二タンパク質が有効な天然スルフヒドリル基を有していない場合、スルフヒドリル付加試薬を用いる前の工程で、それらを別途添加できます。

様々なアプリケーションにおいて、タンパク質複合体の天然構造を維持することが不可欠であるため、一般に架橋は近生理的条件下で実行されます。反応における架橋剤とタンパク質の最適モル比は実験に基づいて決定すべきですが、通例各試薬の製品説明書には、一般的アプリケーションのガイドラインおよび推奨書が添付されています。

アプリケーションに応じて、結合程度は重要な要素です。例えば免疫原結合体を調製する場合、抗原の免疫原性を高めるには結合程度が高いことが推奨されます。しかし抗体または酵素に結合する場合は、タンパク質の生物学的活性を維持するため、低〜中程度の結合が最適です。

また、タンパク質表面上の官能基の個数も考慮しなければなりません。ターゲット基が多数存在している場合、比較的低い架橋剤：タンパク質比を適用できます。ターゲットの潜在数が限られている場合には、比較的高い架橋剤：タンパク質比が必要に求められるでしょう。また、複数成分からなる複合体は分析が困難であり、タンパク質サブユニットの空間的配置に関する情報がほとんど得られないことから、成分の種類は少数または最低限に留めておくべきです。

EDC架橋反応は、外来性のカルボニルおよびアミンを含有しない条件下で実行しなければなりません。最も有効性が高いのは、酸性（pH 5.5～4.5）MESバッファ（4-モルホリノ - エタンスルホン酸）ですが、リン酸バッファ（pH ≤ 7.2）も反応化学に適合します。通例EDC結合プロトコルにはNヒドロキシスクシンイミド（NHS）またはその水溶性類似体（スルホ-NHS）が含まれている、効率性が向上し、より安定性の高いアミン反応性中間体が作製できます（次項をご参照ください）。

ペプチドおよびタンパク質には多数のカルボニルやアミンが含まれるため、直接EDCを媒介した架橋を行うと、通常はポリペプチドのランダム重合が発生します。それでも、固定化手順（例：カルボキシル化表面へタンパク質を付着させる）や、免疫原調製（例：大きなキャリアタンパク質へ小ペプチドを付着させる）において、この反応化学が一般的に利用されています。

一般にNHSエステル架橋反応は、室温または4℃下で0.5〜4時間、リン酸緩衝液（pH 7.2～8.0）中で実行します。トリス（TBS）などの第一級アミンバッファは、反応に競合するため、適合しません；しかし手順タイプによっては、結合手順の最後にトリスやグリシンバッファを添加して、反応をクエンチ（停止）させることができます。

スルホNHSエステルは、Nヒドロキシスク環上にスルホン酸（-SO 3）基を含む点を除いて、NHSエステルと同一です。この荷電基は反応化学へは一切影響を及ぼしませんが、荷電基を含有する架橋剤の水溶性が上昇する傾向があります。また荷電基の効果により、スルホ-NHS架橋剤の細胞膜透過が抑止されるため、この架橋剤を細胞表面架橋法に使用できます。

得られるアミジン結合がプロトン化されるため、架橋は生理的pHで正荷電を有します。これは置換された第一級アミンに極めて類似しています。そのため、タンパク質構造や膜中の分子会合の研究や、天然タンパク質の等電点（pI）を維持したまま固相支持体上にタンパク質を固定化させる用途に、イミドエステル架橋剤が利用されてきました。イミドエステルは現在でも特定手順に利用されていますが、形成されるアミジン結合は高pH環境下で可逆的です。そのため大半のアプリケーションにおいて、安定性と効率性の極めて高いNHSエステル架橋剤が着実に台頭してきました。

短いホモ二官能性マレイミド架橋剤の作用により、タンパク質構造中のジスルフィド架橋がシステイン間の永続性・非還納性の結合へと変換されます。主にマレイミド化学は、ヘテロ架橋剤形態のアミン反応性NHSエステル化学と組み合わせて利用されています。これにより精製ペプチドや精製タンパク質は、制御された2工程で結合させることが可能になります。

反応中に、標的分子の-SH基と架橋剤の2-ピリジルジチオ基間においてジスルフィド交換が起こります。ピリジン-2-チオン（MW 111; 最大λ 343 nm）が副生成物として放出されます。これらは、分光光度法でモニターでき、透析または脱塩によってタンパク質複合体から除去できます。

ヒドラジド化学は、グリコシル化部位を介した糖タンパク質の標識化、固定化または結合に有用です。通常グリコシル化部位は、（大半のポリクローナル抗体と同様に）機能性を保持させたい主要結合部位から離れたドメインに配置します。

アリールアジド化合物は紫外光に曝されると、ニトレン基を形成します。このニトレン基は、C-H部位とN-H部位の二重結合により、もしくはそれらへ挿入されると付加反応が惹起し得ます。また環拡大を起こして、求核試薬（例：第一級アミン）と反応する可能性があります。様々なアミン非含有バッファ条件下で反応を実行することにより、一般的な官能基「ハンドル」を欠いたタンパク質や分子をも結合させることができます。

一般に光反応性試薬は、結合パートナー相互作用を捕捉するヘテロ二機能性架橋剤として使用されます。アミン（またはスルフヒドリル）反応性末端を用いて、精製ベイトタンパク質を架橋剤で標識します。そしてこの標識タンパク質を溶解液サンプルへ添加して、相互作用物質を結合させます。最後に、紫外光による光活性化でフェニルアミド基を介した結合を惹起します。

ジアジリンを光活性化させると、反応性カルベン中間体が作成されます。特定試薬のスペーサーアーム長に相当する距離において、全てのアミノ酸側鎖やペプチド骨格との付加反応を介して、こうした中間体は共有結合を形成できます。翻訳によってアミノ酸の類似体ジアジリンをタンパク質構造へ組み込むことができ、これにより特定の組換えタンパク質を架橋剤として活性化できます。