B細胞の概要

Bリンパ球としても知られるB細胞は、適応免疫応答において重要な役割を果たす白血球の一種です[1]。B細胞は、高親和性抗体を産生し、免疫記憶を形成し、抗原提示細胞として機能し、CCL22、CCL17、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-10、TGF-β1、IL-35などのサイトカインを分泌します。メモリーB細胞とプラズマB細胞は、免疫グロブリン（Ig）IgM、IgG、およびIgEなどの抗体を産生します。このページでは、成熟したB細胞タイプの発現、ならびに細胞培養、イムノアッセイ、イムノフェノタイピングのための細胞マーカーなどB細胞を研究するためのツールについて説明します。

特定の器官や微小環境におけるB細胞の発生は、転写因子の発現により調整されます[2, 3, 4, 5, 6, 7]。各細胞の運命は、特定のB細胞遺伝子の活性化とサイレンシングに依存しており、この発生段階は、表面および細胞内マーカーの発現により評価することができます。ほとんどのB細胞は骨髄（BM）で発生し、続いて二次リンパ器官（SLO）で成熟細胞が発生し、最終的には血液中に循環します。

BMのB細胞は造血幹細胞に由来し、一般的なリンパ前駆細胞または多能性前駆細胞のいずれかに分化します（図1）。一般的なリンパ前駆細胞は、T細胞系統、ナチュラルキラー細胞、またはB細胞系統のいずれかに分化します。B細胞系統の細胞は、特定のBM微小環境内でポジティブおよびネガティブ選択を受けます。

特定のB細胞は、脾臓またはリンパ節などのSLOに遊走します。BMから血液および脾臓に遊走するB細胞は、1型移行期（T1）B細胞と呼ばれます。脾臓に入ると、T1-B細胞は2型移行期（T2）B細胞に成熟します。脾臓では、T2-B細胞は濾胞性（FO）B細胞、辺縁帯（MZ）B細胞、またはB1細胞（ヒト）のいずれかになります。マウスでは、B1への移行はBMで起こります。SLOは、B細胞がそのB細胞受容体（BCR）を介して抗原に結合し、活性化される場です。B細胞はT細胞依存的または非依存的に活性化されます（図2および図3）。一般に、FO-B細胞はT細胞依存的に活性化を受けますが、B1細胞とMZ-B細胞はT細胞非依存的に活性化が促進されます。

B細胞のT細胞非依存型の活性化には、B細胞の表面にあるB細胞受容体（BCR）クラスター（架橋とも呼ばれる）、ならびにToll様受容体（TLR）との結合によりもたらされる二次シグナルが必要です（図2）。BCRの架橋は、BCRが細菌またはウイルスの表面にある進化的に保存された反復エピトープに遭遇したときに生じます[1]。

B細胞のT細胞依存型の活性化には二つのシグナルが必要です。一つ目は、外来標的の抗原表面分子または遊離した可溶性抗原に結合することによるBCRの架橋です。二つ目は、T細胞上のCD40受容体を介したシグナル伝達です（図3）。

図3.B細胞のT細胞依存的な活性化。このタイプの活性化では、メモリー細胞と形質B細胞が生成されます。ナイーブB細胞は、可溶性または膜結合型の抗原に結合し、抗原を取り込みます。B細胞はこの抗原をMHCIIに提示し、ヘルパーT細胞（Th）により認識されます。CD40受容体とリガンドの結合を介した第2のシグナル伝達機序が必要です。サイトカインがTh細胞により分泌され、これによりB細胞は活性化されてIgG、 IgA、または IgE産生が可能な成熟B細胞に分化します[9]。
 

濾胞性（FO）B細胞

濾胞性（FO）B細胞は、リンパ濾胞の胚中心から発生し、ヒトとマウスの両方において主要B細胞サブセットを構成します[1]。それらは主に血中を循環しますが、SLOに存在するものもあります[4]。小さいサブセットは、BMからT細胞依存的な活性化により生じますが、ほとんどのFOB細胞は、脾臓でT細胞非依存的に活性化されます。それらの発生は、強力なBCRシグナル伝達とNotch2シグナル伝達の遮断により引き起こさされます。これらの細胞は、感染時に高親和性抗体の大部分を生成します。これらの細胞は濾胞性ヘルパーT細胞と相互作用します[9]。

辺縁帯（MZ）B細胞

辺縁帯（MZ）B細胞は、血液媒介病原体に対する防御の第一線として機能します[5, 6]。脾臓やその他のリンパ組織のMZに存在するMZB細胞は、大量の循環血液やその血液が運ぶ病原体に遭遇するのに適しています。MZB細胞は、増殖のためにNotch2シグナル伝達に依存する唯一のB細胞です。ヒトの場合、MZB細胞は循環血中だけでなく、体の他の部分にも認められますが、マウスの場合は、MZB細胞は動かず、脾臓に常在します。

形質細胞

形質細胞は、胚中心にある標的に対して高親和性抗体を産生し、免疫記憶を提供します[9, 10, 11, 12, 13]。最初に、SLO胚中心にあるB細胞が、ヘルパーT（CD4）細胞との相互作用により活性化されます。この活性化の間に、B細胞は体細胞超変異と親和性成熟を経て、それ自体の特定の外来抗原に対するB細胞の抗体（BCR）親和性を向上させます。活性化されたB細胞は、BCR受容体アイソタイプクラススイッチング（すなわち、IgGとIgE）を受け、さらに分化して、抗体を産生する形質細胞になります。形質細胞は形質芽球よりも多くの抗体を産生します_。実際、それらの唯一の目的は、細胞あたり毎秒数百から数千の抗体を産生することにあります。BM中の形質細胞は循環する抗体の主な供給源ですが。しかし、この大量の抗体産生により、形質細胞は抗原提示細胞としての機能を失い、短命になる傾向があります。一般に、短命の形質細胞の補充は、メモリーB細胞の活性化により行われると考えられています[14, 15]。

メモリーB細胞

形質細胞とは対照的に、メモリーB細胞は寿命が長く、抗原に再遭遇するまで休眠したままです[1, 2]。メモリーB細胞は、再曝露するとただちに抗原に対する抗体の産生を開始できます。それらの外来抗原に再曝露されると、メモリーB細胞はただちに再活性化し、抗体産生形質細胞に分化します。IgGアイソタイプ抗体がこれらの形質細胞から産生され、特定の外来抗原に対して高い親和性を示します。これらのIgG抗体は、免疫記憶などの二次免疫応答の一部として（特にメモリーBおよびメモリーTリンパ球から）、ウイルスおよび細菌の抗原を迅速に中和するのに効果的です。

B細胞の典型的な特徴はB細胞受容体（BCR）であり、これが適応免疫に寄与します。BCRは、B細胞の膜に存在しており、細胞内シグナル伝達によりB細胞の活性化を促進する機能を持っています。この膜貫通型受容体は、遺伝子の可変（V）領域、多様性（D）領域、結合（J）領域、および定常（C）領域の組み換えにより生成される二つの重鎖と二つの軽鎖で構成されています（図4）[16]。各成熟B細胞は、単一の特異性を持つ1種類のBCRのみを生成するため、同じ単一の特異性を持つ抗体しか産生しません。

図4.B細胞受容体Ig重鎖。BCRの可変（V）領域、多様性（D）領域、結合（J）領域、および定常（C）領域が再結合して、Igが生成されます。相補性決定領域（CDR）は、特定の抗原に結合する可変鎖の一部です。フレームワーク領域（FR）は、BCRの可変（V）領域内で保存されている部位です。
 

分離されたB細胞は刺激がないと自己複製しません。活性化および自己複製するために外因性シグナルに曝露されたB細胞は、培養条件下で分裂します[19, 20]。1つ目のシグナルはBCRによりもたらされ、抗IgMまたはIgD抗体を用いて模倣できます。2つ目のシグナルは、CD40などの共刺激分子の関与とIL-4などのサイトカインシグナルにより達成されます。あるいは、リポ多糖（LPS）などの細菌の細胞壁の成分や反復性の高い分子を有する抗原が、B細胞の活性化を直接促進する可能性があります[21]。

たとえば、成熟、ナイーブ、またはメモリーB細胞を培養する場合、CD40L発現間質フィーダー細胞と、IL-2、IL-4、IL-21、BAFFなどの特定のサイトカインのカクテルを含む培地を使用できます[22]。活性化されたB細胞は、Th細胞との共培養でさらに分化することができます。Th細胞は、共培養されたB細胞と結合して刺激を与えます。活性化されたB細胞はCFSEまたはBrdUを取り込み、細胞増殖を示します。

Epstein-Barrウイルス（EBV）に感染した形質転換株は、休止状態のB細胞を、継続的に増殖するリンパ芽球様細胞株（LCL）に形質転換します。がんサンプルまたはEpstein-Barrウイルス（EBV）感染サンプルに由来する形質転換細胞株には、Akata、MutuI、およびMutuIII細胞などが複数あります。これらの細胞株は、10％ウシ胎児血清（FBS）を添加したRPMI培地で培養できます[18]。

いくつかの最適化されたマルチカラー免疫蛍光パネル（OMIP）が論文報告されており、B細胞集団の表現型を解析するためのフローサイトメトリーパネルの設計に使用できます（表1）。

表1.公開されているB細胞の表現型解析のためのOMIP。

フローサイトメトリーによりB細胞を解析する場合、B細胞のゲーティングは比較的簡単です。ほとんどのマウスおよびヒトB細胞パネルには、細胞表面マーカーCD19またはCD20を含める必要があります。B220は、マウスB細胞のマーカーとして使用できますが、ヒトのpanB 細胞マーカーとしては使用できません。CD19およびIgGの発現を用いてB細胞の表現型を解析するためのゲーティングストラテジーの例を図5に示しています。

図5.B細胞の表現型を解析するためのゲーティングストラテジーの例。SLO組織（脾臓、リンパ節、扁桃腺）や血液を分離し、FACSバッファーで単細胞懸濁液にして、抗体染色を行います。抗体カクテルで染色した後、フローサイトメーターにより細胞を取得できます。以下の順序で細胞をゲートします。最初に単一の生細胞をゲートする必要があります。T細胞、NK細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞などの他の細胞系統をマークする同じ蛍光色素を持つマーカーをダンプチャネルに配置または組み合わせて使用することで、よりピュアな細胞集団が確保されます。その時点で、生きている亜集団はCD19とIgGの発現が陽性となるはずです。FSC-A：リニアスケールでのForward Scatter(前方散乱)Area(面積)。これは、細胞の大きさを測定するために使用されます。FSC-W：リニアスケールでのForward Scatter(前方散乱)Width(幅)。これは、ダブレットを大きさで区別するために使用されます。SSC-W：リニアスケールでのSide Scatter（側方散乱）Width（幅）。これは、ダブレットを粒度で区別するために使用されます。
 

さまざまなサイトカインが、B細胞の増殖、生存、および発現におけるアイソタイプクラススイッチングに影響を与えます。IFN-alphaおよびbetaは骨髄におけるB細胞の生成と選択に関わりますが、IL-4とIL-6はB細胞による特定のクラスの抗体の優先的な分泌に影響を及ぼします。IL-7は、主にB細胞の発現に作用し、生存因子として作用する重要なサイトカインです。

表3：B細胞の分化、増殖、生存、動員、アイソタイプクラススイッチング、および分泌に関与する重要なサイトカイン

ナイーブB細胞は多くのサイトカインを産生しませんが、活性化されたB細胞は、エフェクターおよびメモリーCD4+ T細胞応答の発現など免疫のまざまな側面に影響を与えるいくつかの炎症誘発性および抗炎症性サイトカインを産生します。サイトカイン産生に基づいて、B細胞はさらに抗炎症性サイトカインを産生する「制御性」Bサブセットと炎症誘発性サイトカインを産生する「エフェクター」Bサブセットに分類することができます。サイトカインの他に、活性化されたB細胞は、Th2細胞の動員に関わるCCL22やCCL17などのさまざまなケモカインも分泌します。Invitrogen Cytokine & Chemokine 34-pex human panelおよび36-plex mouse cytokine panelを使用すれば、血漿、血清、または細胞培養中に産生されたB細胞関連サイトカインを費用対効果の高い方法で測定できます。サイトカインとケモカインの検出に加えて、マルチプレックスアイソタイプパネルは、モノクローナル抗体のクラス（例：IgG対IgM）およびサブクラス（例：IgG1対IgG2a）を明らかにする簡便な方法で、ハイブリドーマの開発において不可欠で有益なツールです。