細胞傷害性T細胞の概要

CD8⁺T細胞と呼ばれることの多い細胞障害性リンパ球（CTL）は、適応免疫系の重要な構成要素であり、ウイルスや細菌などの細胞内病原体や腫瘍に対する免疫防御に重要な役割を果たします[1]。ヘルパーCD4⁺ T細胞（Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Tfh、およびTregなど）と同様に、CTLは胸腺で生成され、αβ-T細胞受容体またはTCRを発現します。しかし、CD4⁺ T細胞とは異なり、CTLはCD8⁺補助受容体をその表面に発現し、MHCクラスIに提示された外来抗原に応答します。

ナイーブ／休止CD8⁺ T細胞は、感染を除去するために体をスキャンする細胞傷害性エフェクター細胞への増殖と分化により病原体に応答する圧倒的な能力を持っています。CD8⁺ T細胞が欠如すると、抗腫瘍免疫が阻害され、腫瘍増殖に対する感受性が高まります。D8機能の調節障害は、免疫病理または免疫媒介性損傷につながる過剰な免疫応答の一因となる場合もあります。循環血中およびリンパ節に常在するCD8⁺ T細胞は、ナイーブT細胞、エフェクターT細胞、およびメモリーT細胞のサブセットへの分化状態に応じて古典的に細分化されます。

CD8⁺ T-αβ細胞の発達は、胸腺のリンパ前駆体から始まり、ダブルネガティブ（DN）（CD8^– CD4^–）期、続いてダブルポジティブ（DP）期（CD8⁺ CD4⁺）を経て進行し、その後、胸腺細胞が単一の陽性（SP）CD8⁺ またはCD4⁺ 胸腺細胞になります（図2）[2]。CD8⁺ T細胞の詳述については、DP細胞はペプチド：MHCクラスI複合体との相互作用を介して胸腺皮質でポジティブ選択を受け、CD8⁺ SP 細胞をもたらします。次に、これらの SP 細胞は皮質から髄質に遊走し、そこでネガティブクローン選択を受けて、自己抗原との高親和性相互作用を持つ T 細胞を除去します。最後に、成熟した単一陽性 CD8⁺ T-αβ細胞が循環血中に放出されます。

ナイーブCD8⁺ T細胞は、MHCクラスI分子（主要組織適合遺伝子複合体）に提示された抗原を認識し、活性化されると細胞傷害性CD8⁺ T細胞（CTL）になります（図3）。樹状細胞（DC）などの抗原提示細胞（APC）は、通常、MHCクラスIの環境で内因性ペプチドを提示します。これは、CD8⁺ T細胞上のTCRおよびCD8⁺補助受容体により認識されます。こうして、ウイルス感染または腫瘍細胞から生じる変化したペプチドは、DCにより提示され、DCはTCR結合により抗原特異的CD8⁺ T細胞を活性化します。

CD8⁺ T細胞の活性化には、CD80/86シグナル伝達などの追加の共刺激シグナル、およびDCと活性化CD4⁺ T細胞により分泌されるサイトカインを介したシグナル伝達も必要です[2]。ほとんどのCD8⁺ T細胞の活性化には、最適な刺激に必要な共刺激シグナルの活性化とアップレギュレーション（発現増加）を十分補助するためにCD4⁺ T細胞が必要です。CD4に依存しない活性化は、Toll様受容体を刺激するか、IL-1またはI型インターフェロンの放出を誘導することによりDCを活性化するウイルスや細菌などの特定の感染性病原体でも起こる場合があります。活性化されると、CD8⁺ T細胞はクローン増殖し、表現型的および機能的に異質のエフェクター細胞を生成します。その主な活動は、影響を受けた標的細胞を排除することです。エフェクター細胞の大部分は短寿命であり、感染または腫瘍細胞の除去後にアポトーシスにより死滅します。エフェクター細胞の低い割合（5～10%）が、長寿命のメモリー細胞として以下のようないくつかの異なる表現型へと生き残ります。一次反応を開始した組織に残留する組織常駐在性メモリーT細胞（Trm）、二次リンパ組織を循環するセントラルメモリーT細胞（Tcm）、非リンパ組織の中を循環するエフェクターメモリーT細胞（Tem）。

細胞傷害性、または細胞傷害性CD8⁺ Tリンパ球（CTL）による標的細胞の殺傷は複数の機序を介して起こり、通常はアポトーシスと標的細胞の除去に至る綿密に調整された一連の事象を伴います（図4）[2]。多くのCTLは、細胞傷害性顆粒の放出を介したアポトーシス促進分子の送達により、標的の殺傷を開始します。TCRがMHCクラスIに結合すると、細胞質内に保存されているパーフォリンとグランザイムの合成が引き起こされます。顆粒は接触点で放出され、特定の標的化と限られたバイスタンダーの死滅が可能になります。パーフォリンが標的膜上に集合することにより、標的細胞へのグランザイムの送達が可能になります。グランザイムは、カスパーゼを活性化して細胞死を引き起こすセリンプロテアーゼの一群です。

直接的な細胞間連絡も機能に不可欠です。CD8⁺ T細胞は、リンパ球や感染した標的細胞に発現する受容体FasとFasリガンド（Fas L）のライゲーションによりアポトーシスを誘導できます。活性化されたCD8⁺ T細胞は、IFNγ、TNFα、およびリンホトキシン-αなど、宿主の防御に寄与するいくつかのサイトカインも産生します。IFNγはMHCクラスIの発現を増加させながらウイルス複製を阻害し、感染細胞が認識される可能性を高めます。

抗ウイルス免疫における役割：ウイルス感染後1週間以内に、ナイーブCD8⁺ T細胞はエフェクター細胞に分化します。ウイルス抗原が自然免疫細胞上のいくつかのパターン認識受容体により認識されると、I型インターフェロンが産生されるようになり、これがCD8⁺ T細胞のエフェクター応答の発生を媒介します。マクロファージとDCにより産生されたIL-12は、抗ウイルス性細胞毒性機能の獲得を媒介するT-betの誘導をもたらします。TNFα、IL-15、およびIL-18などの他のサイトカインは、CD8⁺ T細胞応答をさらに増強します。

抗腫瘍免疫における役割：CD8⁺ T細胞は、抗腫瘍免疫の主要な促進要因と考えられています[3]。CD8⁺腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）は、腫瘍抗原の認識と形質転換細胞の直接的な殺傷を通じて腫瘍拒絶を媒介します。腫瘍微小環境にあるエフェクターCD8⁺ T細胞は、IL-2、IL-12、およびIFNγを産生します。これらはCD8⁺ T細胞の細胞傷害能力を促進し、腫瘍細胞を殺傷の標的にします。腫瘍微小環境にある細胞傷害性CD8⁺ T細胞のレベルの上昇は、さまざまな種類のがんにおける抗腫瘍効果および予後の改善と相関しています。

ナイーブCD8⁺は、さまざまな役割を持つ複数のエフェクター表現型に分化させることができます[4]。エフェクターの表現型は、高い細胞傷害性能力とサイトカインの産生を特徴とします。標的細胞の殺傷は、Tc1細胞として分類されるCTLにより果たされます。さまざまなサイトカイン環境により生成されるCD8⁺ T-αβ細胞の他の主要なサブセットには、Tc2、Tc9、Tc17、およびCD8⁺制御性T細胞などがあります[5]。これらの細胞は、さまざまなTヘルパーサブセットと同様に特異的な転写因子を発現し、シグネチャーサイトカインとエフェクター分子を産生します（表1）。

たとえば、細胞傷害性Tc1細胞は、IL-2およびIL-12の存在下で生成され、IFNγなどのサイトカインを分泌する能力を獲得します。細胞傷害性Tc1細胞は、グランザイムBやパーフォリンなどの細胞溶解に関与する分子も産生します。Tc1の生成に関与する転写因子には、T-bet、blimp-1、およびIRF-4などがあります。これに対して、Tc2細胞はIL-4の存在下で誘導され、IL-5とIL-13を産生します。Tc2細胞は、系統特異的な転写因子GATA3に応答して生成されます。Tc1細胞とは異なり、Tc2細胞は低レベルの細胞傷害性しか示さず、アレルギーと自己免疫の発現の要因となっていることが示されています。

反応不顕性または制御性または枯渇したCD8⁺ T細胞は、老化したCD8⁺ CD28^– T細胞であり、増殖の低下と細胞傷害性の可能性が低いことが示されており、IL-10を分泌し、サプレッサーの可能性を有します。CD8⁺制御性T細胞の集団は、頭部がん、頸部がん、および肺がんの研究で認められています。同様に、枯渇したCD8⁺ T細胞は、PD-1、CTLA-4、TIM3、およびLAG3などの受容体を発現します。それらは免疫抑制機能を実行し、免疫回避を媒介します。

表1.CD8⁺ T細胞エフェクターの表現型と機能。

T-αβ細胞サブセットについては、エフェクター記憶分化状態に基づいてさらに特徴を明らかにすることができます[3、5]。これらのメモリーCD8⁺ T細胞は、自己再生能力を特徴とし、リンパ組織および非リンパ組織に常在し、同じ抗原とのその後の遭遇時にエフェクター機能を呼び戻す役割を担っています。メモリーCD8⁺ T細胞は、エフェクター機能の程度、増殖能、および組織ホーミング特性の差異に基づいて、さまざまなサブセットに分類されています。

• セントラルメモリー細胞（Tcm）：これらの細胞は主にリンパ組織に限られ、リンパホーミング分子CD62LおよびCCR7を発現します。
• エフェクターメモリー細胞（Tem）：これらの細胞は、感染防御の第一線で働き、即時型のエフェクター機能を媒介し、循環および非リンパ組織に存在します。リンパホーミング分子CD62LおよびCCR7の発現は低レベルです。
• 組織に常在するメモリー細胞（Trm）：これらの細胞は病原体が侵入する部位にあります。

防御的なCD8⁺ T細胞応答は、これらすべてのエフェクターおよびメモリーサブセットの集合的な機能を通じて達成されます。表2および3では、マウスおよびヒトCD8⁺ T細胞の主要なサブセットの特定に使用されるマーカーをハイライト表示しています。マウスCD8⁺ T細胞の汎マーカーには、CD3、CD5、CD8、CD27、およびCD28があり、ヒトCD8⁺ T細胞の汎マーカーには、CD2、CD3、CD5、CD8、CD25⁺⁺、CD27、およびCD28があります。

CD8⁺サブセットの検出は比較的簡単です。ほとんどの実験では、最適化されたフローサイトメトリーマルチプレックスパネル（Optimized Flow Cytometry Multiplex Panels）（OMIP）に記載しているような特異的なヒトCD8⁺ T細胞の表現型分析でサブセットを検出または分離します[6]。T細胞の活性化、増殖、および分化を評価する他の方法には、サブセットからのサイトカイン分泌の検出などがあります。

表2.CD8⁺ T細胞サブセットの概要とそれらを研究する方法。

PBMCまたは腫瘍組織からのCD8⁺ T細胞の単離は、ex vivoまたはin vitro刺激後の表現型および機能特性を研究するための重要な要件です。免疫磁気選択や細胞選別（セルソーティング）などの抗体を介した分離は、CD8⁺ T細胞を単離するために最も一般的に用いられる手法です。理想的な分離アプローチとなるためには、迅速であることと、精製した細胞の収率と生存率が最大になることが必要です。IL-2は、CD8/CTLの増殖、生存、および機能に不可欠であるため、細胞培養用の培地に添加する必要があります[7、8]。

表3.マウスCD8⁺ T細胞のさまざまなサブセットを識別するための細胞マーカー。

表4.ヒトCD8⁺ T細胞のさまざまなサブセットを識別するための細胞マーカー。

パーフォリンおよびグランザイムBの検出：脱顆粒のアッセイでは、CD8⁺ T細胞の細胞傷害性の可能性について評価します。活性化されたエフェクターCD8⁺ T細胞は、細胞溶解性顆粒のパーフォリンおよびグランザイムBを放出し、これらは腫瘍細胞またはウイルスに感染した細胞の死滅を誘導します。脱顆粒は、フローサイトメトリー手法を用いてモニタリングできます。図6は、CD8⁺ T細胞の細胞傷害性の可能性を検出することを目的としたパーフォリンおよびグランザイム特異的抗体の使用を示しています。

図6.パーフォリンおよびグランザイムBの検出（A）Invitrogen CD8aモノクローナル抗体（クローンRPA-T8）による正常なヒト末梢血細胞の細胞内染色。APC-eFluor 780、eBioscience（カタログ番号47-0088-42）およびInvitrogenマウスIgG2bカッパアイソタイプコントロール（クローンeBMG2b）、FITC、eBioscience（カタログ番号11-4732-42）（左）またはInvitrogenパーフォリンモノクローナル抗体（クローンデルタG9）、FITC、eBioscience（カタログ番号11-9994-42）（右）。リンパ球ゲート内の細胞を分析に使用しました。（B）以下を使用して正常なヒト末梢血細胞を細胞内で染色しました。Invitrogene Bioscience細胞内固定&透過処理バッファーセット（カタログ番号88-8824-00）、Invitrogen CD8aモノクローナル抗体（クローンRPA-T8）、APC、eBioscience（カタログ番号17-0088-42）およびInvitrogenマウスIgG2aカッパアイソタイプコントロール（クローンeBM2a）、eFluor 450、eBioscience（カタログ番号48-4724-82）（左）またはInvitrogenグランザイムBモノクローナル抗体（クローンN4TL33）、eFluor 450、eBioscience（カタログ番号48-8896-42）（右）。リンパ球ゲート内の細胞を分析に使用しました。

CD107/LAMP-1の検出：CD107/LAMP-1の動員は、キラー細胞の細胞傷害性の可能性の尺度です。CD107a糖タンパク質は、休止T細胞の管腔表面を覆っています。活性化されると、溶解性顆粒は標的細胞との相互作用の部位に局在し、原形質膜と一体化します。この過程で、グランザイムおよびパーフォリンがエキソサイトーシスされ、CD107発現が細胞表面に認められます。CD107/LAMP-1の動員は、フローサイトメトリー手法を用いて検出できます（図7）。

In vitroでのCD8⁺ T細胞のポリクローナル活性化については、T細胞の増殖と活性化を目的として、Invitrogen DynabeadsヒトT-活性化因子を用いてCD3/CD28でナイーブCD8+ T細胞を3～4日間培養選別できます（図8）。ヒトT活性化因子Dynabeadsは、in vitroでCD3/CD28を介したT細胞の活性化を誘導することにより樹状細胞を模倣します。分化およびサイトカイン分析を目的として、細胞は活性化後にサイトカインおよび目的の化合物とともにさらに培養する場合があります。CD8⁺ T細胞を維持するために、細胞培養用の培地にIL-2を添加する必要があります[7、8]。T細胞の増殖には限りがあるため、増殖は細胞増殖アッセイで測定する必要があります。

細胞溶解活性はCD8⁺ T細胞の主要な機能であり、いくつかのアッセイを用いて有効性を測定します[9]。

クロム（⁵¹Cr）放出細胞傷害性アッセイ：このアッセイは、細胞媒介性細胞傷害を評価するためのゴールドスタンダードと見なされており、クロム酸ナトリウムからの、標的細胞による⁵¹Crの受動的内在化と結合に依存しています。エフェクターキラー細胞により標的細胞が溶解すると、放射性プローブが細胞培養上清に放出されるため、それをガンマカウンターにより検出できます。この方法は、その半定量的性格と低い感度のために限定的であり、エフェクター細胞を繰り返し刺激するという点で技術的に困難で、細胞の実際の挙動が本来の状態からゆがめられる可能性があります。カルセインAMは⁵¹Crの代替であり、同様のアッセイで使用できます。

アネキシンV結合細胞傷害性アッセイ：アネキシンVには、通常原形質膜の内層に存在するホスファチジルセリン（PS）への高い親和性があります。アポトーシスが誘導されると、PSは外表面に局在し、アネキシンVにアクセス可能となります。これにより、フローサイトメトリーに基づいた便利なアッセイを用いて、エフェクター細胞のキラー活性を検出できます。この細胞傷害性アッセイでは、エフェクター細胞をPKH26、またはCD8⁺に特異的な抗体で標識し、標的細胞とともに培養することができます。標的細胞のアポトーシスは、アネキシンVのFITCまたはPE抱合体（コンジュゲート）で染色することにより検出できます。さらに、アネキシンV結合の測定とPIまたは7-AADの取り込みを組み合わせると、標的細胞のアポトーシスのさまざまな段階を識別するのに役立ちます。
 

活性化されたCD8⁺ T細胞の増殖は、IL-12や1型インターフェロン、IL-2、IL-21、およびIL-27などの炎症性サイトカインに影響されます。IFN、IL-2、およびIL-21などのサイトカインも、短寿命のエフェクターとメモリー前駆体CD8⁺ T細胞の生成のバランスを取る上で重要な役割を果たします。細胞傷害性CD8⁺ T細胞は、IFN-γやTNF-αなどのサイトカインの放出に加えて、パーフォリンとグランザイムの分泌により感染を排除します。IFN-γはウイルス複製を阻害し、マクロファージを感染部位に動員し、そこでマクロファージの活性化においてTNF-αとの相乗作用を働かせることができます。以下の表に、CD8⁺ T細胞のプロファイリングに使用できるいくつかの利用可能なイムノアッセイを要約しています。

マルチプレックスイムノアッセイ