ヘルパーT1細胞の概要

その名前が示すように、ヘルパーT（Th）細胞は、免疫系の他の細胞、特にマクロファージ、樹状細胞、およびB細胞などの抗原提示細胞（APC）にヘルパー機能を付与し、それらの活性化と成熟に重要です。CD4⁺ Th細胞には、Th1、Th2、Th17、T制御性細胞など特異的なサブセットがあり、各サブセットがサイトカインと転写因子の特異的な組合せにより活性化され、それらが分泌するサイトカインと実行するエフェクター機能により特徴付けられます。

Th1細胞は、T細胞のアルファ：ベータ系統に由来し、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIまたはII分子により提示される抗原を認識します。Th1細胞は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、らい菌（Mycobacterium leprae）、およびリーシュマニア（Leishmania）などのウイルスや細菌などの細胞内病原体の識別と根絶に重要な役割を果たします。これらの病原体は、通常、マクロファージなどの細胞内の食作用性小胞の中に常在しており、リソソーム融合を防止することにより、細胞内死滅をしばしば回避します。Th1細胞は、これらの病原体に対してマクロファージを活性化し、これらの微生物回避の対処を解決するのに役立ちます。これに対して、CD4⁺ T細胞の他の主要なサブセットであるTh2細胞は、蠕虫や寄生虫などの細胞外病原体を認識し、B細胞を介した抗体応答を活性化するのに役立ちます。

T細胞発生の最初の段階は胸腺で起こり（図1）、そこでTCF1、GATA3、およびBcl11bなどの特異的な転写因子の発現とともにNotch1シグナル伝達により、T細胞の関与が引き起こされます。アルファ：ベータ系統のすべてのT細胞サブセットは、それらの発生を、胸腺細胞が単一陽性（SP）CD8⁺またはCD4⁺胸腺細胞になる前に、ダブルネガティブ（DN）（CD8^– CD4^–）期、続いてダブルポジティブ（DP）期（CD8⁺ CD4⁺）を経て進行する共通のT細胞前駆細胞（Thp）まで追跡できます。

MHC分子はSP細胞の成熟に重要な役割を果たします。CD4⁺ T細胞は、MHCクラスII鎖の不変領域に結合したCD4共受容体媒介性のMHCクラスII分子が提示する抗原ペプチドを認識します。胸腺細胞の発生におけるMHCと共受容体の相互作用の重要性は、MHCクラスIまたはクラスII遺伝子のいずれかを発現するトランスジェニックマウスを用いた研究により、明白に示されています。MHCクラスII遺伝子がない場合はCD8⁺細胞のみが発生し、MHCクラスI遺伝子がない場合はCD4⁺細胞のみが発生するため、T細胞集団のCD4／CD8バランスが崩れます。

DP細胞は、TCR遺伝子の再配列により救済されない限り、本質的に3～4日の短い寿命となります。アポトーシスからのDP胸腺細胞のこの救済およびその後のSP細胞への成熟はポジティブ選択として知られ、その間に自己MHC複合体を認識するT細胞がさらなる発達のために選択されます。ネガティブ選択と呼ばれる逆のプロセスは、胸腺における自己ペプチド：自己MHC複合体を強く認識したT細胞がアポトーシスにより破壊されるときに起こり、それにより、自己反応する成熟T細胞の有害な活性化が防止されます[1]。

胸腺期の最後に、関与していないナイーブCD4⁺ T（Th0）細胞は、MHCクラスII分子が提示した抗原を探すために二次リンパ器官に向けて去ります。抗原が認識されると、ナイーブT細胞はクローン増殖およびさまざまなエフェクターサブタイプへの分化を経る一方で、いくつかはメモリーT細胞に発達します。分化系統は、サイトカイン、転写因子、共刺激シグナル、および接着分子の環境にかなり影響されます。

Th1分化に重要な役割を果たす2つのサイトカインは、IFNγとIL-12です。T細胞の関与時にAPCが分泌するIL-12は、STAT4転写因子の活性化を通じてTh1エフェクター細胞への分化を引き起こします。STAT4はIFNγ産生を誘導します。これは、Th1分化に向けて転写因子STAT1とTbetを活性化することによるもう1つの促進要因です。Tbetは、IFNγのより多くの発現を誘導し、Th1応答を強化するための正のフィードバックループにつながるため、Th1分化のマスター制御因子と見なされます[1、2、3]。

表1.Th1細胞の発生を引き起こす遺伝子発現とサイトカインの変化*。

また、抗原認識により、特徴的なマーカーCD45ROを発現するメモリーTh1細胞が生じます。メモリー細胞は、それに続く抗原性刺激後の堅牢でより速い免疫反応にとって重要です。CD4⁺メモリー細胞には次の3種類があります：中央メモリーT細胞（TCM）、エフェクターメモリーT細胞（TEM）、および組織常在性メモリーT細胞（TRM）。TCM細胞は高い増殖能を有する一方で、TEMは低い増殖能を有しますが、高い炎症性エフェクター機能が認められます。CD4+メモリーT細胞の分化にはさまざまなモデルがあります（[4]で概説）。あるモデルでは、メモリーT細胞の分化にはいくらかの柔軟性があるとはいえ、Th1エフェクター細胞がTEMメモリー細胞を生じさせる可能性があるという仮説が立てられています。メモリーT細胞分化のサブセットは、サイトカイン環境と転写因子活性により導かれます。

共刺激（または共阻害）分子はAPC上で発現し、T細胞上の分子と相互作用して、生成されるシグナルを増強または減少させます。さらに、シグナルを調節することにより、開始される転写プログラムに変化を引き起こすこともできます。それゆえに、これらの分子は、T細胞の分化やさまざまな系統の結末において重要な役割を果たします[2、3、5]。

表2.Th1の分化と機能にとって重要な共刺激分子。

マクロファージ、B細胞、およびCD8⁺細胞傷害性Tリンパ球（CTL）などの他の免疫細胞の細胞溶解性および他のエフェクター機能の活性化など、Th1細胞の主なエフェクター機能は細胞性免疫と炎症にあります。Th1を介した他の免疫細胞の活性化の最初のステップの1つは、Th1細胞の表面にあるCD40リガンド（CD40L）と、マクロファージ、B細胞、樹状細胞の表面に発現するCD40との相互作用です。エフェクターTh1細胞は豊富な量のIFNγも分泌し、Th1集団をさらに広げるだけでなく、200を超える標的遺伝子の誘導を通じてマクロファージの細胞溶解活性を活性化します。マクロファージにおけるこの増加した細胞毒性活性は、ウイルス、細胞内細菌、および原生動物などの細胞内病原体を死滅させるのに重要です。Th1依存性免疫応答の標準的な例は、マイコバクテリア感染中に認められます。マイコバクテリアはマクロファージ内のリソソーム融合を回避します。しかし、感染したマクロファージの表面にMHCクラスIIにより提示されるこれらの病原体由来のペプチドは、Th1応答の活性化を引き起こし、マクロファージの細胞溶解特性をオンにします。

細胞内感染の除去に加えて、Th1応答はCD8⁺細胞傷害性Tリンパ球を活性化して腫瘍を標的として破壊する上で重要な役割を果たし、さらにはCTLの生存と記憶の増強につながります。また、CD40はB細胞のクラス切換えを活性化してIgG2a抗体を産生します[5]。

表3.Th1細胞により分泌されるサイトカインとそれらの機能。

Th1集団は、2つの異なる方法で取得を達成できます。

• 磁気ビーズに基づく分離またはFACSによりT細胞画分（たとえば、ナイーブCD4⁺ T細胞）を分離し、これらの細胞をin vitroで活性化して特異的なTh1亜集団に分化させます。
• 全血の末梢血単核細胞から直接Th1亜集団を分離します。

T細胞画分の分離は、通常、Ficoll*密度勾配遠心から開始し、T細胞とB細胞および単球（PBMC）を含む最上部の間期層であるバフィーコートを分離します。Ｔ細胞集団は、PBMCからポジティブまたはネガティブ選択のいずれかにより単離できます。ポジティブ選択では、T細胞特異的抗体を使用してT細胞集団を濃縮します。ネガティブ選択では、B細胞などの他の集団に対する抗体を使用して、これらの集団をサンプルから特異的に除去します。ポジティブ選択では、T細胞またはT細胞サブセットを最初にCD3やCD4などのT細胞系統マーカーに対するビオチン化抗体で標識し、続いてInvitrogen Dynabeadsストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを添加します。Ficoll密度勾配分離の詳細な説明と記述、およびT細胞の磁気ビーズに基づくポジティブ選択の概略図は、T細胞刺激および増殖eLearningコースにあります。

あるいは、FACSを使用して、サンプルからナイーブCD4⁺ T細胞を単離することもできます。フローサイトメトリー分析では、通常、細胞表面タンパク質と細胞内タンパク質（サイトカインや転写因子など）に対する蛍光マーカーの組合せを用います。

CD4⁺集団が単離されると、T細胞の活性化と刺激は、抗CD3および抗CD28抗体を使用してTCRとCD28受容体を架橋および刺激することにより達成できます。抗CD3と抗CD28抗体に共有結合した磁気ビーズは市販されています。たとえば、Invitrogen Dynabeads磁気ビーズは、T細胞発現CD28を介した共刺激シグナルと、T細胞受容体を介した主要シグナル伝達の両方を誘導することにより、最適なレベルのT細胞活性化と増殖を誘導します。Th1のin vitro分化プロトコルは、ナイーブCD4⁺ T細胞をIL-12およびIFNγで処理するときに利用できます[5]。Flaherty S, Reynolds JM（2015）マウスナイーブCD4⁺ T細胞の単離、マーカー用のT細胞サブセットへのin vitroでの分化、ならびにナイーブCD4⁺ T細胞を単離するためのゲーティング概略図（Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into T cell subsets for markers and a gating scheme to isolate naive CD4+ T cells）をお読みになることをお勧めします。

*Ficollは、GE Healthcare社が所有する登録商標です。

通常、サイトカインプロファイリングを用いることにより、Th細胞サブタイプを分類し、また分泌されるサイトカインの量を定量化します。サイトカインELISAを用いて、集団レベルでの活性化および系統特異的分化に応答したT細胞依存性サイトカイン分泌をモニタリングできます。数百の個々のサイトカインの検出と定量に適したサイトカインELISAキットが市販されています。これらのキットは、通常、捕捉抗体であらかじめ被覆した96ウェルプレートとして販売されており、検出用抗体、ならびに標準液、バッファー、および付属品試薬が含まれています。アッセイ感度は、通常、ピコグラムの範囲内にあります。

ELISAは個々のサイトカインの分泌の測定に使用できる一方で、Luminexマルチプレックス化技術の進歩により、単一のサンプルまたは反応ウェル内の複数のサイトカインのハイスループット検出が可能になります。複数のサイトカインの同時測定は、異なる強度の蛍光物質で染色されたマイクロスフェアに結合した抗体のバンクを用いて達成されます。定量は、Luminex検出系と組み合わせたサンドイッチアッセイアプローチを用いて達成されます。Invitrogen Th1／Th2サイトカイン11-PlexヒトProcartaPlexパネルは、Luminexプラットフォームを用いて11のサイトカインのパネルを検出します。

ELISAに基づく方法に加えて、Th1および他の免疫集団を研究するための別の一般的で強力なツールはフローサイトメトリーです。ELISAでは分泌されたサイトカインの量を測定するのに対して、フローサイトメトリーは、表面発現マーカーまたは細胞内マーカーの両方、ならびにサイトカイン発現に基づいて細胞をプロファイルするために使用できます。さらに、フローサイトメトリーを用いて、他の集団に関してTh1集団を定量化することができます。雑誌Cytometry Part A（Wiley Online Library）に論文報告された、最適化された多色免疫蛍光パネル（OMIP）に、フローサイトメトリーによる細胞種の広範囲な特性評価のための特異的抗体と蛍光物質の組合せの使用が説明されています。OMIP-030（表面マーカーを介したヒトT細胞サブセットの特性評価）およびOMIP-008（ヒトT細胞のTh1とTh2サイトカイン多機能性の測定）は、Th1集団を研究するための有用なOMIPです。フローサイトメトリーに基づくTh1細胞の同一性と試験は、Invitrogen eBioscience必須ヒトTh1／Th17表現型分類パネルと&染色刺激試薬を使用して実施することもできます。