マクロファージ細胞の概要

マクロファージは、自然免疫系の特殊な長寿命の食細胞です。マクロファージは、好中球とともに感染に対する最初に応答して機能します[1]。マクロファージは、細胞の破片や病原体の認識、食作用、および分解に関与します[2]。マクロファージは、T細胞への抗原提示、ならびに他の抗原提示細胞種上での共刺激分子の発現の誘導においても機能し、適応免疫応答を開始します[1]。さらに、マクロファージはサイトカインとケモカインを放出することにより、炎症の開始に重要な役割を果たし、サイトカインとケモカインが、他の免疫細胞を炎症部位へ動員させます[3]。

マクロファージはほとんどすべての組織で発生するため、異なる機能的能力を持っています。病原体に対する免疫応答と炎症反応の開始に加えて、マクロファージは組織の恒常性の維持、ならびに組織の修復と再構成において機能します[4] [5]。残念ながら、この機能は、代謝性疾患や自己免疫疾患、がん、感染症、肥満、および線維症など多くの疾患に関連しています[5] [6]。そのため、マクロファージは、腫瘍微小環境、特にマトリックス再構成、血管新生、転移、および腫瘍の進行においても重要な役割を果たしていると考えられます[5]。

マクロファージには多くの起源があります。組織に常在するマクロファージは、骨髄内の造血幹細胞から発生する循環性単球から分化するか、胎児肝臓、卵黄嚢や背側大動脈近くの胚領域で発生し、そのため、成人期には単球とは独立して維持されます[3] [5] [6]。前者の種類の発生は、単球が定常状態または炎症時のいずれかに組織に遊走する能力によリ達成され、その後、骨（破骨細胞）、中枢神経系（ミクログリア（小膠細胞））、結合組織（組織球）、および肝臓（クッパー細胞）のマクロファージ、ならびに肺胞（塵埃細胞）、腸、脾臓、および腹膜のマクロファージなど持続性の組織特異的なマクロファージに分化します[7]。ミクログリア細胞とクッパー細胞は、インターロイキン34（IL-34）の存在下で自己複製することができます。IL-34はこれらの組織内で発現され、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）と同じ受容体に結合します[3]。マクロファージは、多くの異なる組織や臓器に分布し、機能しているため、さまざまな形態や表現型を示します[5]。

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マクロファージは、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）および樹状細胞（DC）に加えて、3種類の食細胞種の1つです。微生物が宿主に入り複製を開始するや否や、これらの食細胞種の1つにより認識され、採り入れられて破壊されます。これは、食作用と呼ばれるプロセスです。ほとんどの病原体は、呼吸器系、腸粘膜、皮膚病変、または泌尿生殖路を通って宿主に侵入します。マクロファージは粘膜下組織に集合するため、通常、病原体に遭遇する最初の防御細胞です。食作用は、特定の食細胞受容体（通常は病原体特異的な炭水化物または脂質構造物）が病原体表面と相互作用するときに開始されます[3]。

この最初の相互作用に続いて、食細胞原形質膜はファゴソームと呼ばれる大きな膜で囲まれたエンドサイトーシス小胞（エンドソーム）内に病原体を包囲し、取り込みます。次に、ファゴソームは、1つ以上のリソソーム（抗菌ペプチドと酵素を含む小胞）と融合して、ファゴリソソームを形成します。リソソームの内容物はファゴリソソーム内に放出され、ファゴリソソームは酸性化と酵素プロセスを経て、反応性の高い一酸化窒素とスーパーオキシドラジカルを生成して病原体を死滅させます[3]。

食細胞受容体の例として、デクチン-1とマンノース受容体（CD206）の2つが挙げられます。どちらもC型レクチン様ファミリーのメンバーです。デクチン-1はマクロファージと好中球により発現され、真菌の細胞壁に通常認められるグルコースポリマーに結合します。CD206はマクロファージとDCにより発現され、真菌、細菌、およびウイルスが共有するさまざまなマンノシル化リガンドに結合します[3]。

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マクロファージの分類は、シグナル伝達分子、増殖因子、転写因子、エピジェネティックおよび転写後の機序と変化、ならびにサイトカイン、細胞間接触、代謝物などのニッチシグナルなどさまざまな因子に応じて異なる表現型とマクロファージの活性化状態に達するため、依然として非常に見解が分かれるトピックです[5] [8][9]。さらに、マクロファージは、微生物やリポ多糖（LPS）などの微生物産物に直接反応して活性化状態を変化させることができます[10]。しかし、マクロファージの活性化は、炎症や疾患の発症のみならず、組織の恒常性にも重要な役割を果たします[5]。一般にマクロファージはその機能と活性化に基づいて分類することができ、標準的に活性化されたM1マクロファージ、および代替的に活性化されたM2マクロファージの2つのサブタイプに分けられます。

M1マクロファージは、主にTh1細胞の動員、病原体耐性、および自然および適応免疫応答を介した腫瘍制御において機能します[13]。M1マクロファージへの二極化は、病原体、LPS、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）、およびヘルパーT1（Th1）細胞サイトカインインターフェロンガンマ（IFN-γ）により、標準的に活性化されます。マクロファージのM1二極化への促進には、IRF/STAT、LPS/TLR4、およびNF-κB/PI-3キナーゼ経路など多くの経路が関与しています[14]。

特徴として、M1マクロファージは高い抗原提示活性と、インターロイキン1（IL-1）、IL-6、TNF-αなどの炎症誘発性サイトカインの高産生、ならびに一酸化窒素（NO）と活性酸素種（ROS）の高産生を示します[12]。さらに、M1マクロファージはIL-12とIL-23の発現増加（アップレギュレーション）およびIL-10の発現減弱（ダウンレギュレーション）を示します[13] [5]。M1マクロファージを刺激すると、IL-1b、TNF-α、IL-12、IL-18、およびIL-23の分泌レベルが高まります。さらに、M1マクロファージ表現型は、主要組織適合遺伝子複合体クラスII（MHC II）、CD68、CD80、およびCD86、ならびにCXCL9とCXCL12などTh1細胞誘引ケモカインを高レベルで発現することが示されています[12]。

表1.ヒトM1マクロファージマーカー。これらのマーカーを使用して、M1マクロファージを他の細胞種から識別できます。

表2.マウスM1マクロファージマーカー。これらのマーカーを使用して、M1マクロファージを他の細胞種から識別できます。

M2マクロファージは、寄生虫や真菌感染、免疫複合体、アポトーシス細胞、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、IL-13、TGF-b、およびヘルパーT2（Th2）サイトカインIL-4により、ならびにTh2細胞を介したIL-33およびIL-25により代替的に活性化されます[12] [15]。マクロファージをM2状態に促進する基本的なシグナル伝達には、STAT6、IRF4、PPARδ、およびPPARγが必要です[11]。

標準的に活性化されたサブタイプとは対照的に、代替的に活性化されたサブタイプは、IL-12およびIL-23の発現減弱（ダウンレギュレーション）とIL-10およびIL-1RAの発現増加（アップレギュレーション）という反対の発現プロファイルを示します[13] [5]。その上、M2マクロファージは、炎症性サイトカインIL-1、IL-6、およびTNF-αの産生が低いことを示します。M2マクロファージは、病原体のクリアランス、抗炎症反応、代謝、ならびに創傷治癒、組織再構成、免疫制御、腫瘍進行、および悪性腫瘍において機能します[12] [15]。

M2表現型は、CD206、CD163、CD209、FIZZ1、およびYm1/2の発現により特徴づけることができます。通常、このサブタイプは、マンノースとガラクトースの食作用と除去に必要な受容体の高発現、ならびにアルギナーゼ経路を介したオルニチンとポリアミンの高産生を示します[12]。このマクロファージ種により発現されるケモカインは、CCL1、CCL17、CCL18、CCL22、およびCCL24です[11]。

M2マクロファージのそれぞれの刺激に応じて、4つのM2サブタイプが確立されています。M2a、M2b、M2c、およびM2dこれらのサブタイプは、細胞表面マーカー、分泌されたサイトカイン、および生物学的機能に基づいて互いに異なります。しかし、すべてのM2マクロファージサブタイプには共通のIL-10発現がみられます[11]。

• M2aマクロファージ：IL-4またはIL-13による活性化。次に、IL-4はマンノース受容体（CD206）の発現を引き起こします。IL-10、TGF-b、CCL17、CCL18、およびCCL22のさらなる発現増加（アップレギュレーション）は、細胞増殖、組織修復、およびエンドサイトーシスを促進することが示されています[11]。
• M2bマクロファージ：免疫複合体、Toll様受容体（TLR）リガンド、およびIL-1bによる活性化。このサブタイプは、活性化すると炎症誘発性および抗炎症性サイトカインであるTNF-α、IL-1b、IL-6、およびIL-10を放出します。M2bマクロファージは免疫応答と炎症の制御において機能します[11]。
• M2cマクロファージ：グルココルチコイド、IL-10、およびTGF-b（および不活化マクロファージ）による活性化。このサブタイプは、抗炎症性IL-10、線維化促進性TGF-b、CCL16、CCL18、ならびにアポトーシス細胞の食作用を促進するMer受容体チロシンキナーゼ（MerTK）の高発現を特徴とします[16]。
• M2dマクロファージ：TLRアンタゴニスト、IL-6、およびアデノシンによる活性化。アデノシンはIL-10と血管内皮増殖因子（VEGF）の発現を引き起こし、次にそれらが血管新生と腫瘍進行を促進します[11] [16]。

表3.ヒトM2マクロファージマーカー。これらのマーカーを使用して、M2マクロファージを他の細胞種から識別できます。

表4.マウスM2マクロファージマーカー。これらのマーカーを使用して、M2マクロファージを他の細胞種から識別できます。

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マクロファージは、免疫系の一部として疾患との闘いにおける制御された役割の他に、慢性炎症、自己免疫疾患、およびがんにおいても負の役割を果たすことができます。通常の免疫応答では、炎症誘発性マクロファージは炎症誘発性シグナルの大きさと時間を制限するように制御されています。長期にわたる傷害の間、調節不全のマクロファージは継続的に炎症性サイトカインを分泌し、他の免疫細胞を動員します。これらのプロセスは慢性炎症を持続させ、腫瘍の開始と促進に重要な役割を果たすと考えられています。腫瘍が形成されると、マクロファージは免疫学的に活性な状態から免疫抑制状態に分化することができます。大部分のがんは、これらのいわゆる腫瘍関連マクロファージ（TAM）が非常に多く存在し、患者の予後不良に関連しています。創傷治癒中の不十分に制御された応答では、マクロファージが線維症を引き起こす場合もあります。マクロファージが主要なプレーヤーとなる他の慢性疾患には、アテローム性動脈硬化症、喘息、炎症性腸疾患、および関節リウマチなどがあります[6]。

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マクロファージは、全血（PBMC単離、マクロファージ分析、マクロファージへの単球刺激）または組織や腫瘍（組織または腫瘍サンプルからの単一細胞懸濁液調製物）から単離および分析できます。さらに、THP-1細胞（急性単球性白血病）、U937細胞（組織球性リンパ腫）、ならびにRAW264.7細胞（マウス白血病単球マクロファージ）およびJ774A.1細胞（マウスBALB/c単球マクロファージ）などヒトおよびマウスの単球細胞株が市販されています[17]。

マクロファージを単離する方法は、磁気ビーズ結合抗体による細胞の分離、密度勾配分離、レーザー捕獲顕微解剖、および蛍光活性化セルソーティング（細胞選別）（FACS）などいくつかあります[18]。単離後、マクロファージの機能と表現型は、遺伝子発現分析、機能研究、サイトカインとケモカイン産生の評価、免疫蛍光染色、イムノアッセイ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロッティング、またはPCRを用いたタンパク質発現と細胞表面マーカーの分析により分析し特徴を明らかにすることができます。すべての分析方法に単離が必要とされるわけではないことに留意してください[18]。

組織や腫瘍から得たマクロファージを分析または処理する場合、通常、組織や腫瘍の切片または単一細胞懸濁液のいずれかを調製します。組織または腫瘍切片は、免疫組織化学的（IHC）染色および分析に直接使用できます。単一細胞懸濁液を調製するには、組織または腫瘍を解剖した後、酵素により消化します。単一細胞懸濁液を使用して、表面マーカーのフローサイトメトリー分析などの方法を用いた直接分析を行うことができます。

必要に応じて、蛍光活性化セルソーティング（細胞選別）（FACS）または磁気ビーズ結合抗体細胞分離法を用いて、マクロファージを単一細胞懸濁液から分離できます。FACSによる分離では、細胞表面マーカーに特異的な蛍光物質抱合型抗体を使用して細胞サブセットを染色し、次にセルソーターを用い、規定された選別基準に基づいて染色された細胞を選別します。磁気ビーズ結合抗体による細胞の分離では、細胞特異的表面マーカーに特異的な抗体が磁気ビーズに接着し、これらのビーズとともに細胞懸濁液をインキュベートします。選択された表面マーカーを特徴とする細胞がビーズに結合すると、未結合のすべての細胞が懸濁液から洗い流され、目的の細胞種がビーズから分離します。

その上、単離されたマクロファージを、さらに培養および刺激することができます。通常、M1マクロファージを刺激してM2マクロファージに再プログラムすることができ、その逆も可能です。マクロファージの培養液を使用して、ELISA、Invitrogen ProcartaPlexイムノアッセイなどのビーズに基づくIA、およびさまざまなサイトカインの定量のためのInvitrogen ProQuantum高感度イムノアッセイなどのPCRに基づくIAなど、qPCRアッセイ、ウエスタンブロッティング、またはさまざまなイムノアッセイ（IA）に使用できる細胞溶解物（ライセート）または細胞培養上清の刺激や生成をすることができます。マクロファージの機能は、食作用アッセイを行うことによっても調べることができます[17]。

全血からマクロファージを分析または処理する場合、通常の手順では単球を単離し、それらをマクロファージに分化させます。それゆえに、PBMCは、Ficoll Paqueを用いて密度勾配分離により全血から単離されます。この方法では、全血中の異なる細胞種間の密度の差異を利用します。続いて、CD14+単球は、FACSまたは磁気ビーズ結合抗体による細胞の分離のいずれかを用いてPBMC懸濁液から単離されます。たとえばInvitrogen Dynabeads Untouchedヒト単球キット（製品番号11350D）、Invitrogen Dynabeads CD14（製品番号11149D）またはInvitrogen Dynabeads FlowCompヒトCD14キット（製品番号11367D）。別の費用対効果の高い単離方法は、単球が優先的に接着する組織培養プラスチック器具内でのPBMC懸濁液の培養であり、単球細胞数はゼラチンコーティングされた表面を用いて増加します。

ナイーブマクロファージまたは二極化したM1やM2マクロファージをin vitroで得るために使用されるさまざまな刺激／分化手法があります。単球をさらに単離する必要がない場合、単離されたPBMCは、15%ウシ胎児血清（FCS）を添加したGibco RPMI 1640培地とインキュベートすることにより、マクロファージを直接産生できます。

単離された単球は、特別な分化培地を使用してナイーブマクロファージに分化させることができます。たとえば、二極化したマクロファージは、増殖因子GM-CSFおよびM-CSFを使用して単球から産生できます。単球は、10% FCSおよび10 ng/mL GM-CSF（Gibco GM-CSF組み換えヒトタンパク質、製品番号PHC2013）または10 ng/mL M-CSF（Gibco M-CSF組み換えヒトタンパク質、製品番号PHC9501）を添加したRPMI1640培地中で7日間刺激することが可能で、それぞれM1およびM2マクロファージの分化が引き起こされます。刺激後、細胞は細長い形状で接着することになります。

あるいは、M1およびM2二極化マクロファージは、異なるサイトカインで単球を連続的に刺激することにより得ることができます。続いて、10% FCSを添加したRPMI 1640培地で回収した細胞を、10 ng/mLリポ多糖（Invitrogen eBioscienceリポ多糖（LPS）溶液、製品番号00-4976-03）および50 ng/mL IFN-γ（Gibco IFN-γ組み換えヒトタンパク質、製品番号PHC4031）で24時間処理してM1マクロファージを得るか、20 ng/mL IL-4（Gibco IL4組み換えヒトタンパク質、製品番号PHC0041）で24時間処理してM2/M2aマクロファージを得ます。免疫複合体とIL-1bまたはLPSで処理すると、M2b活性化が引き起こされ、IL-10、TGF-b、またはグルココルチコイドを添加すると、M2c活性化が生じます[14] [19] [20]。マクロファージの種類は、免疫組織化学的染色またはフローサイトメトリーを用いて、表面上に特定のマーカーを発現させることにより識別できます（表5）。

表5に、マクロファージの識別（一般的な表現型）およびそれらの特性評価（機能的特徴）に使用できるマーカーを記載します。マーカーの位置（表面または細胞内）は、これらの抗原の検出に用いる方法に影響します。

表5.細胞マーカーの非網羅的リスト。記載されたマーカーを使用して、ヒトおよびマウスのマクロファージの特徴を明らかにすることができます。

従来のM1/M2モデルをin vitroで培養および刺激された細胞に適用して、さまざまな種類のマクロファージ活性化を説明できるにもかかわらず、組織マクロファージの複雑なネットワークに関する新しい知見により、in vivoでのこれらの細胞の機能的な多様性と表現型の多様性を適切に説明できないことは明らかです[21] [22]。したがって、複数のマーカーの発現と機能特性に基づいて、単純なM1/M2モデルを、マクロファージのより柔軟で包括的な説明に置き換えることをお勧めします。しかし、M1とM2の表現型を定義するために使用される正統なマーカーは、マクロファージの特性評価において依然として重要な役割を果たします。ここでは、マクロファージの特徴を明らかにすることを目的とした誘導型一酸化窒素シンターゼ（iNOS、NOS2）、アルギナーゼ-1（Arg1）、マンノース受容体（CD206）、RELM-a（FIZZ1）、およびCD163などこれらの従来型マーカーについて説明します。

iNOSおよびアルギナーゼ1

マクロファージの標準的活性化と代替的活性化の2つの歴史的に正統なマーカー（少なくともマウス細胞では）は、それぞれiNOSとArg1です（図4）。iNOSは、L-アルギニンからL-シトルリンと一酸化窒素（NO）へのNADPH依存性酸化を触媒する酵素です。一酸化窒素は、細胞傷害性およびその他の生理機能（血管弛緩など）の重要なメディエーターです。iNOSはマクロファージで構成的に発現されておらず、その存在は、IL-1、TNF-α、またはIFN-γなどの炎症誘発性サイトカインにより過去に刺激を受けたことを確実に示します。

酵素Arg1は、L-アルギニンを尿素とL-オルニチンに変換します。Arg1はアルギニンを分解することにより、iNOSからその基質を奪い、一酸化窒素の産生を減弱させます（ダウンレギュレーション）。Arg1はマクロファージ内でIL-4とIL-13により強く誘導されますが、IL-10やTGF-bなどの抗炎症性サイトカインにより誘導されません。iNOSの発現とは対照的に、Arg1のベースライン発現は組織マクロファージの複数の集団でみられます。たとえば、ほとんどのマウスの大きな腹膜マクロファージ（F4/80高マクロファージ）は、定常状態でArg1陽性です。図4に示すように、Arg1はIFN-γで刺激された一部のマクロファージ内でも検出できます。したがって、特に初代培養されていない細胞を分析する場合、Arg1をM2二極化の完全に特異的なマーカーと見なすべきではありません。

マンノース受容体（CD206）

CD206またはマンノース受容体C1型（MRC1）として知られるマクロファージマンノース受容体は、真菌、細菌、原虫、およびウイルス抗原の食作用およびエンドサイトーシスによる取り込みを媒介し、免疫防御とその制御に重要な役割を果たします。マンノース受容体は、代替的に活性化されたマクロファージの最初の識別マーカーでした。Arg1とは対照的に、CD206は、IL-10またはグルココルチコイドで処理された免疫寛容性細胞など代替的に活性化されたマクロファージの広範囲のスペクトル全体にわたって発現されます。興味深いことに、TGF-bはCD206の発現を減弱させる（ダウンレギュレーション）ことが示されています。この受容体の発現を阻害する他の因子には、LPS、IFN-γ、およびTNF-αなどがあります。Arg1と同様に、CD206は複数の種類の組織マクロファージにより構成的に発現されますが、その発現パターンはArg1の発現パターンと完全には重複していません。図5の右のパネルは、小型（F4/80低）および大型（F4/80高）の腹膜マクロファージ内のCD206の構成的発現を示しています。

RELM-a (FIZZ1)

RELM-aは、レジスチン様アルファまたはFIZZ1としても知られ、IL-4およびIL-13により強く誘導され、寄生虫感染に対する応答に関与する小型のサイトカインです。Arg1と同様に、RELM-aはグルココルチコイドやIL-10により誘導されません。これにもかかわらず、M2活性化のこれら2つの通常使用されるマーカーのin vivo発現パターンは非常に異なります。たとえば、刺激がない場合、RELM-aは大部分の小型の腹膜マクロファージ（F4/80低）と少数の大型の腹膜マクロファージ（F4/80高）により発現されます（図6）。

CD163

CD163はハプトグロビンとヘモグロビンの受容体です。その主な機能は鉄のリサイクルプロセスを促進することであるため、CD163の最高レベルの発現は赤脾髄マクロファージ内で観察できます。CD163は特定の細菌化合物も検出でき、程度は低いものの、クッパー細胞、腸粘膜固有層マクロファージ、および大型の腹膜マクロファージの一部など組織マクロファージの他のサブセット内で発現されます（図7）。ヒトCD163とは異なり、マウスCD163はM2二極化サイトカインにより容易に誘導されず、マウスM2マクロファージの良好なマーカーではありません。代わりに、その発現は組織特異的なマクロファージ機能（ヘモグロビンのリサイクルなど）を示しているようです。

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