ヘルパーT17細胞の概要

CD4⁺ヘルパーTリンパ球は、B細胞や細胞傷害性T細胞などの他の免疫細胞の活性化、および免疫応答の制御に重要な役割を果たす細胞性免疫のメディエーターです。CD4⁺ヘルパーT細胞は、サイトカイン分泌とエフェクター機能を特徴とするサブセットにさらに分割され、自然免疫細胞からの信号に応答して末梢で分化します[1]。後述するこれらのサブセットの最初の2つはTh1とTh2です[2]。IL-17Aサイトカインの分泌に起因してTh17と呼ばれる新規のCD4⁺ヘルパーTサブセットが発見されるまでの数十年間、存在が認められたサブセットはこの2つだけでした[3、4]。Th17細胞は、特に粘膜障壁と上皮障壁で細胞外病原体に対する宿主防御において役割を果たしますが、異常な活性化はさまざまな自己免疫疾患の病理発生に関連付けられています[5]。

ヘルパーT細胞の他のサブセットと同様に、Th17細胞は、T細胞受容体（TCR）抗原刺激および抗原提示細胞により分泌されるサイトカインの活性化に応答して、末梢でナイーブCD4⁺細胞から分化します[6]。分化はもともとIL-23により誘導されると考えられていましたが、後にTh17の発生がこのサイトカインとは独立的に起こることが明らかにされました。しかし、IL-23は依然としてTh17の維持と増殖に重要であると考えられており、その受容体（IL-23R）は活性化されたTh17細胞中で発現が増加（アップレギュレーション）します[6]。その代わり、Th17分化の不可欠なサイトカインメディエーターは、IL-6またはIL-21と組み合わさったTGFβであることが確認されています[6、7]。IL-6とIL-21は、STAT3シグナル伝達を介してTh17転写制御因子の発現を促進し、CD4⁺ T細胞をTh17系統に関与させます。このシグナル伝達経路が欠損すると、IL-23R、主要なTh17関連転写因子、およびIL-17AやIL-17Fなどのエフェクターサイトカインの発現低下が伴います[7]。

Th17分化のマスター制御因子の候補は、レチノイン酸関連の孤立した核ホルモン受容体ファミリーのメンバーであるRORγtとして最初に同定されました[6]。この転写因子はIL-17AおよびIL-17Fの発現を誘導することが認められ、その欠損にはTh17の発生と機能の低下が伴いましたが、まったくなくなったわけではありません[6、7]。後の研究では、関連する転写因子であるRORαも、RORγtと同様にSTAT3に応答してTh17分化とサイトカイン発現を促進する可能性があることが認められました[8]。RORαとRORγtは相乗的に作用してTh17の関与を促進し、両方の因子の欠損が組み合わさると、Th17の発生が完全に阻害されます[8]。

Th17の発生に役割を果たすその他の転写因子は、IRF4、BATF、およびAHRです。IRF4は、RORγtの発現を増加させる（アップレギュレーション）ナイーブCD4⁺ T細胞の能力が欠如しているため、RORγtの上流にあると考えられますが、Th17生物学におけるその正確な役割は十分には理解されていません[9]。AHRは T 制御性細胞と共有される核因子ですが、Th17 細胞でより高いレベルで発現します。AHR が欠如した状態でも Th17 分化に影響しませんが、エフェクターサイトカイン、特にIL-22の産生は大幅に減少します[10]。最後に、BATFはTh17細胞の生成とそれに伴うサイトカインの発現に必要であることが明らかにされていますが、BATFはTh17系統に特有のものではなく、BATF欠損細胞は依然としてRORαとRORγtを誘導できることが認められています[11]。

Th17系統は高度な適応性を示し、環境的な信号の変化に応じて他のCD4⁺ヘルパーTサブタイプに分化転換することが観察されています。T制御性細胞は、その分化をTGFβに依存するもう1つのヘルパーTサブセットです。このサイトカインの濃度が高くなると、ナイーブ細胞はFoxp3の発現に偏る傾向があり、Th17の発生が強く阻害され、代わりに制御性表現型への関与が促進されます[12]。これにもかかわらず、高いレベルのIL-6および結果として生じるSTAT3シグナル伝達は、特にIL-1の存在下で、TGFβで誘導されたT制御性細胞のTh17関連遺伝子に有利に働いてFoxp3発現を減弱させる（ダウンレギュレーション）ことがあります[13]。Th17細胞の分化転換は主にTh1およびT制御性サブセットで認められている一方で、Th2、T濾胞性ヘルパー、およびTR1細胞との共有機能のエビデンスも存在します[14]。異なるCD4⁺ヘルパーT細胞サブセットの複数の転写マスター制御因子が共発現される場合があるという観察結果から、これらの系統間に機能的柔軟性がある可能性がいっそう確認されました[15]。

CD4⁺ヘルパーT細胞のエフェクター機能は主に分泌型サイトカインにより媒介され、各サブセットが産生した特異的なサイトカインのプロファイルは、各集団の表現型の確定に使用される主な特徴の1つです[1]（図2）。Th17細胞は、数十年持続した元のTh1/Th2パラダイムとは異なることが確認された最初のサブセットであり、IL-23に応答したIL-17Aホモ二量体の発現に基づいて最初に特徴が明らかにされました[1、3]。Th17細胞は、後に別のホモ二量体IL-17ファミリーメンバーであるIL-17F、ならびにIL-17Aの1つのサブユニットとIL-17Fの1つで構成されるヘテロ二量体タンパク質IL-17AFを産生することが認められました[16]。IL-17を介した応答は、上皮細胞、内皮細胞、および線維芽細胞においてもっともよく特徴が明らかにされており、これらは、TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8、CXCL1、CXCL8、およびG-CSFの分泌により、IL-17Rシグナル伝達に応答し、好中球の動員と炎症反応を促進します[17]。

IL-10ファミリーのメンバーであるサイトカインIL-22も、Th17細胞により分泌されることが認められましたが、その誘導はIL-17Aの誘導とは異なります[18]。IL-22の発現は、Th17分化サイトカインであるTGFβおよびIL-6のシグナル伝達よりもIL-23シグナル伝達に大きく依存しており、より完全に分化したTh17細胞により分泌されることが示唆されます[18]。その受容体は、IL-22R1とIL-10R2のヘテロ二量体複合体であり、主に非造血細胞上で発現されます。IL-22とその標的細胞との相互作用は、細胞外病原体に対する宿主防御、β-ディフェンシンなどの抗菌ペプチドの分泌、および創傷治癒の促進の要因となります[17]。

多面作用性のサイトカインIL-21は、Th17細胞などさまざまなCD4⁺ T細胞により発現され、これらの細胞の発生と機能に重要な役割を果たすことも明らかにされています。Th17細胞では、IL-21がIL-6と同様の方法でSTAT3シグナル伝達を介してRORγt発現を誘導することにより、オートクライン（自己分泌）様式で機能し、Th17の関与をさらに増強することができます[19]。IL-21は、Th17応答を引き起こすだけでなく、Th1細胞、CD8⁺細胞傷害性T細胞、およびNK細胞の機能を増強することにより、細胞性免疫を促進します[20]。B細胞の成熟、最終分化、および機能もIL-21シグナル伝達に依存しています[21]。

Th17細胞は粘膜免疫の維持に不可欠である一方で、それらの調節障害は自己免疫性炎症の病理発生に関与しています。標準的なTh1／Th2モデルとは異なるCD4⁺ヘルパーT細胞の3番目のサブセットの存在が最初に示唆されたのは、この炎症を引き起こす際のそれらの役割でした。元のモデルでは、Th1細胞は自己免疫の主なメディエーターであると考えられていました。しかし、それらの主要なTh1エフェクターサイトカインであるIFNγまたはそれらの活性化サイトカインであるIL-12が欠如すると、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）などの自己免疫性炎症のモデルが悪化することが明らかにされました[22]。IL-12／IFNγではなくIL-23／IL-17系が、この炎症を媒介する主な経路として特定され[23]、その後の研究では、この系に関連する新規のCD4⁺ヘルパーTサブセットとしてTh17細胞の特徴が明らかにされました[3、4]。それ以来、Th17細胞は、関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、および炎症性腸疾患などの他の自己免疫疾患の進行に役割を果たすことが明らかにされています[5]。Th17サイトカインIL-17AおよびIL-17Fは、標的組織において炎症誘発性サイトカインの産生を引き起こします。これにより、好中球などの自然免疫細胞の動員を通じて炎症が媒介されるだけでなく、正のフィードバック様式でさらなるTh17活性化が促進されます[5]。高いレベルのIL-6およびIL-1βにより引き起こされる分化は、より炎症誘発性の役割をもたらすと研究が示唆しているように、それらのサイトカインが組織保護または病原性の表現型の方向に発現するかは、Th17分化につながる正確で環境的な信号により決まります[13]。現在の研究では、自己免疫の治療標的としてTh17細胞とそのサイトカイン産物を探索し続けています。

Th17細胞の浸潤は、健康な組織と比べてさまざまな悪性腫瘍で認められていますが、それらの動員の特異的な機序は不明であり、全体的な予後への影響は多様です[14]。IL-17サイトカインは、より高い血管新生に関連しているため、一部のモデルでは腫瘍の増殖と転移が増加します。また、Th17細胞はより免疫抑制性の表現型に分化転換する可能性があり、腫瘍の免疫回避に役割を果たすことも認められています[14]。しかし、Th17細胞がCD8⁺細胞傷害性T細胞および樹状細胞を腫瘍部位に動員する能力は、いくつかの環境因子の存在下でIFNγ分泌Th1表現型に変換するという観察された能力と同様に、腫瘍クリアランスを促進することが明らかにされています[14]。全体的に、がんの進行においてTh17細胞が果たす役割は、特定の腫瘍微小環境に大きく依存しているように見えます。この柔軟性を利用して抗腫瘍応答に向けてそれらを操作することは、がん免疫療法の開発において有益な戦略であることが証明されるかもしれません。

ヒトおよびマウスのTh17細胞の単離と研究のためのサーモフィッシャーサイエンティフィックによるいくつかの一般的に使用される方法とツールを以下に説明します。

末梢血、組織、および腫瘍から単離された細胞を使用するフローサイトメトリー分析は、Th17の生物学と機能を研究するために広く使用されています。フローサイトメトリーによるTh17細胞の特性評価は、通常、IL-17Aなどの主要なエフェクターサイトカインまたはRORγtなどのマスター転写制御因子のいずれかを、汎CD4表面表現型マーカーと組み合わせて細胞内染色することに依存しています。これらの細胞の内因性の柔軟性と不安定性により、Th17細胞の単一表面表現型マーカーを特定する試みは困難になっていますが、いくつかの候補が示唆されています。CCL20に応答して細胞遊走を引き起こすケモカイン受容体であるCCR6は、Th17細胞により発現され、炎症組織への動員に関与しています[24]。しかし、CD4⁺ CCR6⁺集団には不均一性が存在し、Th17細胞だけでなく、関連するTh22およびTh17.1サブセットも含まれる場合があります[24]。Th17とTの制御性系統間の柔軟性により、Th17細胞に対する唯一の表面表現型マーカーとしてCD4と組み合わせたCCR6の使用がさらに複雑になります。ヒトでは、マウスNK細胞マーカーNK1.1のヒトホモログであるCD161とCD39の共発現も、Th17系統の可能性のあるマーカーとして示されています[25]。フローサイトメトリー用のTh17細胞マーカーの一部のリストを表1に示します。

最適化された多色免疫表現型分類パネル（OMIP）は、フローサイトメトリーパネルを構築する際の有用な参考になります。本パネルでは、マーカーと蛍光色素の既報の組合せを提供するだけでなく、分析のためのゲーティング戦略も提案しています。表2に、Th17生物学に関連するOMIPを記載しています。

表1.フローサイトメトリーによりTh17細胞の特徴を明らかにするためのマーカー。マーカーは、追加情報の列に特記がない限り、ヒトとマウスの両方の生物学に関連しています。

表2.Th17細胞の特性評価に関連する最適化された多色免疫表現型分類パネル（OMIP）。

イムノアッセイは、細胞培養培地および体液中の可溶性タンパク質のレベルを定量化するための有益なツールです。それらは一般的にサイトカイン発現の研究に使用され、これには活性化されたTh17細胞により分泌されるエフェクターサイトカインなどが含まれる場合があります。Th17研究のためのイムノアッセイには、溶液中の単一分析物のレベルを検出する酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、またはLuminexプラットフォームを用いて同じサンプル内の複数のタンパク質を定量化する複合的なマルチパラメーターパネルの両方を含めることができます。サーモフィッシャーは、Luminex技術を介してTh17やその他のヘルパーT細胞サイトカインを検出するためのさまざまなInvitrogen ProcartaPlexマルチプレックスパネルを提供しています。Th17生物学に関連するパネルのリストについては、下の表3に記載しています。

表3.Th17研究用のInvitrogen ProcartaPlex Luminexパネル。

分極を誘導するために組み換えサイトカインを使用し、また、Th1/Th2系統の発現を促進するサイトカインからのシグナル伝達を防止するために機能的抗体を用いて、in vitroでCD4⁺ T細胞からTh17細胞を分化させることができます。特定のTh17マーカーの発現は正確な培養条件に応じて異なる場合があるため、細胞選別（セルソーティング）または磁気ビーズ濃縮キットによりCD4⁺として選択されたリンパ球を用いて培養を開始し、詳細な分化プロトコルを参照して適切な時点と試薬濃度を明らかにすることをお勧めします。表4に、Th17細胞をin vitroで培養するために一般的に使用される試薬を記載します。

表4.Th17細胞のin vitro培養用試薬。推奨濃度とタイミングについては、プロトコルを参照してください。