ナチュラルキラー細胞の概要

ナチュラルキラー（NK）細胞は、事前の活性化を必要とせずに細胞を選択的に溶解します。NK細胞は、自然リンパ球（ILC）のファミリーに属しており、自然免疫系の一部として、免疫監視とそれに続くウイルス感染およびがん細胞に対する宿主防御に重要です。ヒトでは、NK細胞は循環しているリンパ球の8～20%を占めます。同系交配の実験用マウスでは、NK細胞は脾臓と骨髄にみられるリンパ球の2～5%を占めます[1,2]。B細胞、T細胞、およびナチュラルキラーT（NKT）細胞など他のリンパ球とは異なり、NK細胞はクロノタイプB細胞受容体やT細胞受容体／CD3ε複合体などの抗原特異的な受容体を発現しません。その代わり、NK細胞は抗原に依存しない、概して免疫学的記憶や長期の防御免疫をもたらさない仕方で機能します。最近の研究では、NK細胞ががん治療の治療標的になり得ることが示唆されています[3]。

ヒトNK細胞は、骨髄（BM）と、扁桃腺、脾臓、リンパ節など二次リンパ組織（SLT）で発生し、成熟します[4]。発生は6つの異なる段階で起こります（表1）。ステージ1はBM内でのみ起こる一方で、ステージ2から6はBMまたはSLTのいずれかで起こる可能性があります。造血幹細胞は、リンパ球系の偏りまたは骨髄系の偏りいずれかを伴う多能性前駆細胞（MPP）に発達します。MPP細胞から、前駆体NK細胞、次に未成熟NK細胞、そして最後に成熟NK細胞に発達する一般的なリンパ球系前駆細胞が現れます。前駆体NK細胞（NKP）は、成熟NK細胞にのみ分化でき、T細胞、B細胞、骨髄細胞、または赤血球細胞には分化できません[1]。ヒトNKの発生段階は、主にCD34、CD117、CD56、およびCD94の発現レベルに基づいています。CD56発現の増加はNKの成熟に重要であり、CD94/NKG2Aの発現が密接に続きます。インターロイキン2/15受容体ベータ（CD122）は、NK細胞発生後期の重要なマーカーでもあります。

表1.ヒトNK細胞の発生段階に発現する細胞マーカー。

マウスNK細胞は、機能的にはヒトNK細胞に類似していますが、異なる発生マーカーを発現し、主に特殊な骨髄微小環境で発生します[5]。NK細胞の発生は、前駆体NK細胞（NKP）上でのCD122発現から始まり、6つの特異的な段階を経て推移します（表2）。NK細胞受容体NKG2D/A/C、CD62L、Ly49、およびCD117（c-Kit）を順次獲得すると、マウスNK細胞の成熟につながります。CD51とCD49bの発現はマウスNK細胞成熟の初期段階を明示し[5,6]、CD43（ロイコシアリン）とCD11b（Mac1）の発現とLy49受容体の獲得は最終段階を明示します。KLRG1の発現により、マウスNK細胞のサブセットはSLTに遊走するように誘導されます。マウスNK細胞の追加の機能分類は、CD27とCD11bを使用して行います[5,6]。

表2.マウスNK細胞の発生段階に発現する細胞マーカー。

ほとんどの正常で健康な細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスI分子を発現し、MHCはこれらの細胞に自己としての印を付けます。NK細胞阻害性受容体が同族のMHCクラスI分子を認識すると、NK細胞の細胞傷害性機能のスイッチがオフとなり、NK細胞がこれらの細胞を死滅させるのを防止します。MHCIの発現が低い非自己標的細胞を認識する能力を獲得するには、NK細胞を教育し、同族の阻害性受容体を使用して宿主MHCクラスI分子を検出する必要があります。このプロセスはチューニングまたはライセンシングとも呼ばれます。

また、NK細胞はIL-2、IL-15（樹状細胞によりトランス提示される）、IL-18、IL-12、およびIFNαなどのサイトカインによる初回刺激（プライミング）のプロセスを通じて環境に適応します（図1）[7,8]。隣接する細胞との相互作用に続くさまざまな経路（阻害および活性化）の統合により、NK細胞の活性化を制御し、NK細胞を活性化して標的細胞を死滅させ、サイトカインを産生するかどうかが決まる動的平衡が制御されます。自然免疫系は一般的に免疫学的記憶の能力を欠いていると考えられています。しかし、最近の知見によると、一部のNK細胞は長寿命であり、異常な細胞やウイルスに対して堅牢な記憶力応答を起こすことが可能です[5,6,7]。

NK細胞は事前の活性化を必要とせずに免疫監視と宿主防御が可能であるため、細胞表面受容体の発現は不可欠です。NK細胞は、接着受容体のみならず、活性化受容体と阻害性受容体の両方を発現します。これらのNK細胞受容体は感覚系として機能し、その結合とそれに続くこれらの受容体からの下流シグナル伝達とのバランスにより細胞応答が決定されます。

成熟した循環性NK細胞（ヒト：CD56+、マウス：Cd49b+）は、複数の活性化受容体を構成的に発現します（表3）。NK細胞は、すべての成熟した循環NK細胞が、ジスルフィド結合ホモ二量体として、またはFCRγとCD3ζの場合はジスルフィド結合ヘテロ二量体として存在するFCRγ、CD3ζ、およびDAP12I型膜貫通アンカータンパク質を構成的に発現するという点で免疫細胞の中で独特です。最も重要なのは、細胞質ドメインにおいて、これらのタンパク質には配列（D/E)XXYXX(L/I)_X6–8YXX(L/I）で定義される免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ITAM）が含まれていることです。これらのXは任意のアミノ酸を表し、スラッシュは所定の位置を占める場合のある代替アミノ酸を分けており、X_6–8は任意の2つのYXX(L/I)要素間の6～8個のアミノ酸を示します。DAP12とFCRγには単一のITAMがあり、CD3ζには鎖ごとに3つのITAMがあります。これらのタンパク質のかなり短い細胞質ドメインには他の既知のシグナル伝達モチーフはなく、ITAMチロシン残基が変異するとそれらのシグナル伝達機能が失われます。活性化受容体がリガンド結合すると、これらのITAM含有アダプター分子を介して下流のシグナル伝達が促進されます。ITAMは、NK活性化受容体と結合すると、Srcキナーゼによってリン酸化され、チロシンキナーゼSykとZap70の結合および活性化が起こります[9,10,11,12]。

NK活性化受容体のうち重要なファミリーの1つは、NKp30、NKp44、およびNKp46を含む自然細胞傷害性受容体（NCR）です。これらの受容体は、刺激されるとNK細胞に強力なシグナルを伝達することにより、有害な細胞が溶解し、IFNγなどの炎症性サイトカインが産生されます。NCRは、成熟した循環NK細胞上に発現し、さまざまなウイルス感染およびがんの制御に重要な役割を果たします。

2番目の重要な活性化受容体であるNKG2Dは、ヒトNK細胞上で発現すると、細胞質アダプタータンパク質DAP10と会合して、他とは異なるシグナル伝達カスケードを開始するという点で独特です。DAP10は、PI3Kの結合と活性化を可能にするYINMモチーフを持っています。さらに、DAP10はGrb2と結合し、Grb2はVav1と会合します。NKG2DはNK細胞前駆細胞の初期段階から発現し、細胞溶解活性における役割に加えて、NKG2Dが結合すると他の活性化NK受容体の発現増加（アップレギュレーション）が誘導されます[12]。

表3.NK細胞活性化受容体。

NK細胞阻害性受容体（表4）は、NK細胞を不活性状態に維持します。一部の阻害性NK受容体は、MHCクラスI分子に特異的であるのに対し、他の受容体は非MHCリガンドに結合します。キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）や白血球免疫グロブリン様受容体（LILR）などのこれらの阻害性NK受容体の一部は、免疫グロブリンスーパーファミリーの単量体のI型糖タンパク質である一方で、Ly49やCD94-NKG2A受容体などの他の受容体は、C型レクチン様足場を持つII型糖タンパク質です。すべての阻害性受容体は、細胞質領域で共通の免疫受容体チロシンに基づく阻害性モチーフ（ITIM）を共有しています[10,11,12]。

表4.NK細胞阻害性受容体。

ほとんどのNK細胞は血管系に常在するので、血管外漏出を経て、炎症、感染、または腫瘍形成の部位に遊走しなければなりません。接着受容体（表5）はこのプロセスに重要なものであり、NK細胞が活性化されると、これらの受容体の発現が増加します[9,10,11]。

表5.NK細胞接着受容体。

免疫監視の間、NK細胞は絶え間なく他の細胞と接触します。NK細胞は事前の感作または活性化なしにウイルス感染細胞上や腫瘍細胞上に細胞溶解活性を誘導できるため、死滅させるかどうかの決定は、NK細胞表面上の活性化受容体と阻害性受容体からのシグナルのバランス次第です。上記のNK細胞教育で説明したように、NK細胞は自己細胞と相互作用してこれらの細胞を認識する方法を学習します。この相互作用は、健康な細胞上のMHC（HLA）クラスI分子に特異的に結合するNK受容体による阻害性シグナル伝達により媒介されます（図2）。MHCクラスI分子が、活性化シグナルのない状況下で標的になり得る細胞上に存在する場合、NK細胞はその細胞を免疫学的自己として認識し、細胞溶解活性はITIMを介したシグナル伝達により減弱されます。MHCクラスI分子が存在しないか、腫瘍細胞上またはウイルス感染細胞上で発現が減弱（ダウンレギュレーション）される（自己喪失）と、阻害性受容体シグナル伝達が失われ、NK細胞の活性化とそれに続く細胞溶解活性が生じます。誘導された自己の死滅プロセスは、NK細胞活性化受容体がウイルス感染または腫瘍形成に応答して標的細胞上に発現されたリガンドから活性化シグナル伝達を受け取るときに起こります。この活性化シグナル伝達により、阻害性シグナル伝達が無効になり、NK細胞の活性化とそれに続く細胞溶解活性がもたらされます[9,10,11,12]。

NK細胞は、主として末梢循環中に常在するため、標的になり得る細胞に遭遇するには血管から抜け出さなければなりません。ウイルスに感染した細胞または腫瘍細胞により放出された化学誘引物質は、血管内皮の炎症を促進し、変化した内皮を探知すると、NK血管外漏出と化学誘引物質放出部位への遊走が促進されます。循環、経内皮遊走（TEM）、走化性、および炎症部位への接触走性からのNK細胞の拘束、および炎症部位での接着は、β₁およびβ₃インテグリンにより媒介されます。炎症部位または腫瘍形成部位で、NK細胞はインテグリン、特にLFA-1の相互作用を介して標的になり得る細胞と相互作用します。

標的になり得る細胞との相互作用中、NK細胞受容体のレパートリーにより、阻害性シグナルと活性化シグナルのバランスを通じて相互作用のアウトカムが決定されます。NK細胞のシグナル伝達バランスが活性化に有利に働く場合、NK細胞は、NK細胞を介した死滅に必要なシグナル伝達と細胞構造の変化を進めます。このシグナル伝達の決定は、標的になり得る細胞とNK細胞が緩い接触をしている場合に起こります。死滅させるという決定が下されると、NK細胞は標的細胞に堅く接着します。NK活性化受容体を介したシグナル伝達により、インテグリンLFA-1への裏返しのシグナル伝達が促進され、インテグリンLFA-1はインテグリンのクラスター化とシグナル伝達を促進します。LFA-1を介した接着により、アクチン細胞骨格の再構成が誘導され、NK細胞と標的細胞の間に堅固な溶解性シナプスが生成されます（図3）。その後の溶解性シナプスへのMTOC二極化とチューブリンの再編成と集合が起こり、溶解性顆粒が溶解性シナプス内に分泌されるようになります（図4）。溶解性顆粒の収束と二極化は、NK細胞が細胞傷害性に関与する前に阻害性シグナル伝達の影響を受けやすい最終段階を表しています。標的細胞に対して二極化した後、脱顆粒する前に、溶解性顆粒を含むパーフォリンとグランザイムBが溶解性シナプスにドッキングし、原形質膜と融合します。パーフォリンが放出され、標的細胞の膜反転と急速なアポトーシスが誘導されます（ビデオ1）[13,14,15]。

グランザイム（顆粒分泌酵素）は、ナチュラルキラー（NK）細胞および細胞傷害性リンパ球（CTL）のリソソーム顆粒内に貯蔵されているセリンプロテアーゼのファミリーです。グランザイムは、標的細胞のアポトーシス誘導に重要であり、細胞内基質を切断し、多くのアポトーシス経路を始動させて標的細胞を確実に死滅させます。グランザイムは、ウイルス、腫瘍、および細胞内細菌に対する免疫防御にも重要な役割を果たします。より最近の研究により、グランザイムは、組織の破壊と血管の完全性をもたらす細胞外の役割を担っており、グランザイムが多くの炎症性疾患や老化関連疾患に関与していることが示されました。このファミリーは、免疫機能と監視に関与するタンパク質の重要なグループとして顕在化しています。

グランザイムA

グランザイムAは、NK細胞傷害性およびCD8+細胞傷害性T細胞顆粒内で最も豊富なセリンプロテアーゼです。グランザイムAは、ミトコンドリア内で始まり、活性酸素種（ROS）が生成され、最終的に一本鎖DNA損傷が活性化される新規のプログラム細胞死経路を活性化するのみならず、ヒストン、ラミン、およびKu70やPARP-1などのいくつかの重要なDNA損傷修復タンパク質など他の重要な核タンパク質を分解の標的にします。また、グランザイムAは炎症誘発性活性も示しており、IL-1、TNF-α、およびIL-6を活性化し、まだ理解されていない他の作用を持つ可能性があります。

グランザイムB

グランザイムB（GrB）は、NK細胞と細胞傷害性T細胞の両方の顆粒にみられます。グランザイムBは、さまざまな細胞傷害性T細胞内でのmRNAの同定に基づいて、CGL1（カテプシンG様-1）およびCTLA-1（細胞傷害性Tリンパ球関連セリンエステラーゼ1）としても報告されていますが、非細胞傷害性リンパ球細胞内では認められていません。グランザイムBは、細胞傷害性T細胞との相互作用で誘導されるアポトーシスによる標的細胞死の迅速な誘導に不可欠です。グランザイムBは、カスパーゼの細胞内カスケードを活性化し、最終的に標的細胞を死滅させます。

グランザイムK

グランザイムAと同様に、グランザイムKは、基質特異性が重複しているが同一ではないトリプターゼセリンプロテアーゼです。グランザイムKはROSの生成を誘導するにもかかわらず、Bid（BH3相互作用ドメイン死亡アゴニスト）-依存性のミトコンドリア損傷を介してカスパーゼ非依存性の細胞死も誘導します。データは、グランザイム-Ｋがp53に結合して切断することも示しています。この切断は、腫瘍細胞の媒介型死滅を刺激すると報告されています。複数の細胞死経路を活性化することにより、キラー細胞はさまざまな細胞内病原体や腫瘍に対してより良好に防御できるようにみえます。グランザイムKも、細胞外型がPAR-1の活性化を通じてヒトの肺線維芽細胞からのサイトカイン産生を誘導できることが示されているため、炎症誘発性である可能性が示唆されます。

ヒト初代NK細胞は、末梢血単核細胞（PBMC）から単離できます。PBMCは、ヒトの血液または末梢血白血球から単離できます。NK細胞は、Invitrogen Dynabeads UntouchedヒトNK細胞キットなどの免疫磁気ビーズを使用してPBMCから単離できます。NK細胞のセルソーティング（細胞選別）は、免疫磁気ビーズの代替手段です。CD56とCD16は特異的なヒトNK細胞マーカーであり、他のリンパ球からの混入なしにNK細胞の同定と単離ができます（図5）。

NK細胞上のCD56の状態から、表現型の特性が分かります[1]。CD56^LowCD16^HiNK細胞は、ほとんどの循環性NK細胞を構成し、CD56^HiCD16^-/LowNK細胞はより小さな部分を占めます。CD56^HiNK細胞は、IL-12による刺激に応答して増殖し、サイトカインを産生します。CD56^LowNK細胞は細胞溶解性が高く、その活性化受容体が結合するとかなりの量のサイトカインを産生します。CD56^LowNK細胞はCD56^HiNK細胞から分化します。NK細胞は、活性化および阻害性の受容体の発現に関して不均一な集団です。

培養中のNK細胞は、in vivoで単離された細胞とは異なる挙動を示し、異なるマーカーを発現します。IL-2と培養されたNK細胞は、CD57⁻CD56^低NK細胞サブセット上でCD57発現を誘導します。CD57⁺NK細胞は高度に成熟しており、細胞傷害性能力、CD16を介した刺激に対する感受性、サイトカインに対する反応性の低下、および増殖能力など複数の特性を示す場合があります。

マウスNK細胞は、免疫磁気ビーズまたはセルソーティング（細胞選別）のいずれかによりマウス脾臓から単離できます[16]。単細胞懸濁液は、CD49b+、NK1.1+、およびCD3-に分類できます。すべてのマウスNK細胞は、IL-2を添加した培地で維持する必要があります。

初代ヒトNK細胞は最大8週間培養できます。NK細胞は、10%ヒトAB+血清、2 mM Gibco CTS GlutaMAX-I、1 mM ピルビン酸ナトリウム、および100 U/mL rIL-2および25 U/ml rIL-15を添加したGibco Advanced RPMI 1640培地で維持できます。NK細胞の増殖は、フィトヘマグルチニン（100 ng/mL）の存在下で放射線を照射されたK562細胞と6～9日間共培養することにより達成できます。NK細胞はCD56⁺/NKG2D^+Hiに必要であり、100 ng/mLフィトヘマグルチニンを含む完全RPMI中で放射線を照射されたK562とともに培養する必要があります。初代NK細胞増殖中の標的細胞増殖を防止するため、K562細胞に放射線を照射（6000ラド）する必要があります。

ヒトNK細胞の細胞傷害活性の定量的測定は、標的細胞K562を使用して測定できます（図6）。標的細胞とNK細胞は、Gibco Hanks緩衝生理食塩水（HBSS）中で4℃で5 μg/mLフィブロネクチンで一晩コーティングしたThermo Scientific Nunc MicroWell 96ウェル、細胞培養処理、平底、光学ポリマーベースマイクロプレートなどの細胞培養処理プレートに共播種する必要があります。次に、1 x 10⁵ (K562)細胞の密度の標的細胞を各ウェルに添加し、10 ng/mL SDF-1αの存在下、37℃で1時間かけて接着させます。次に、ウェルをHBSSで洗浄します。5 x 10⁵の密度のNK細胞を含むHBSSを各ウェルに3連で加え、37℃でインキュベートします。細胞傷害性は、Invitrogen生／死細胞媒介性細胞傷害キットを用いて蛍光イメージングにより検出できます。イメージングでは、EVOS Onstageインキュベーターを備えたInvitrogen EVOS M7000イメージングシステムを使用して細胞をイメージングし、Invitrogen Celleste画像分析ソフトウェアを用いてデータを分析できます。あるいは、ハイコンテント分析プラットフォームを使用して細胞を画像化し分析することもできます。

あるいは、フローサイトメトリー分析では、標的細胞をInvitrogen CellTrace色素で染色した後、Invitrogen SYTOX色素の存在下でエフェクターNK細胞とインキュベートすることができます。NK細胞が接着して標的細胞を死滅させると、細胞膜が透過性になり、SYTOX色素が入って核酸に結合し、定量化可能な蛍光を発します。フローサイトメトリーについては、研究者はInvitrogen AttuneNxTフローサイトメーターを使用できます。

さらに、以下のフローサイトメトリープロトコルを使用してNK細胞を評価することができます。OMIP-029：ヒトNK細胞の表現型化とOMIP-027：ヒトナチュラルキラー細胞の機能分析。

個々のサイトカインがいくつかの効果を発揮するとはいえ、通常、NK細胞の完全な活性化、増殖、生存、およびエフェクター機能には、異なるサイトカインの組合せが必要です。NK細胞機能の正のサイトカイン制御因子には、主にTh1細胞、マクロファージ、および樹状細胞により産生されるIL-2、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21、およびIFG-gがあります。これに対して、Th2細胞が分泌するサイトカインIL-4、IL-5、IL-10、または腫瘍細胞が分泌するIL-1β、IL-6、IL-10、IL-23、IL-35、TGFβはNK細胞機能を抑制できます。

表6：NK細胞の活性化、抑制、および分泌に関与する重要なサイトカイン。

NK細胞発生には少なくとも5つの異なる段階があり、NK細胞発生のこれらの段階におけるさまざまなサイトカイン受容体の表面発現により、異なるサイトカインは1つの発生段階から次の発生段階への移行に関連していることが示唆されます。さらに、ナチュラルキラー細胞に基づくがん免疫療法を用いる新しい機会が現れるにつれて、腫瘍微小環境におけるサイトカインと免疫チェックポイント阻害剤の役割、およびそれらがNK細胞に与える影響を理解することが不可欠になります。活性化されたNK細胞は、イムノアッセイを用いて測定できるGM-CSF、IL-10、IL-5、IL-13、IFN-γ、ランテス、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β、およびIL-8などさまざまなサイトカインやケモカインを分泌します。その上、LAG-3、CD96、TIM-3、TGIT、およびPD-1などのNK細胞上で発現される免疫チェックポイントマーカーは、すべて血清または血漿中で測定できる可溶型を持っています。

マルチプレックスイムノアッセイ