Search Thermo Fisher Scientific
ChIP、RIP、タンパク質-核酸プルダウン用の磁気ビーズおよびキット
クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイは、転写因子やヒストンDNA結合タンパク質関連などのゲノム領域を特定するため行います。ChIPアッセイでは、DNAに結合するタンパク質は一時的に架橋され、DNAは細胞溶解の前に切断されます。標的タンパク質は架橋されたヌクレオチドの配列にしたがって免疫沈降され、そしてDNAが取り除かれてPCRで同定され、 配列が決められ、マイクロアレイにかけられ、または他の方法で分析されます。
RNA免疫沈降法はChIPと似たアプローチを取りますが、DNA結合タンパク質の代わりにRNA結合タンパク質が免疫沈降されるところだけが異なっています。免疫沈降されたRNAはその後RT-PCRとcDNA シーケンシングで同定されます。
クロマチン免疫沈降（ChIP）
MAGnify™ Chromatin 免疫沈降システムは迅速でさらに再現性のあるソリューションをクロマチン免疫沈降（ChIP）に提供し、目的の抗体に対してChIPを行うために必要なすべての試薬が含まれています。
ChIPアッセイ手順
クロマチン免疫沈降アッセイ（ChIPアッセイ）は、ヒストン修飾（エピジェネティクス）または転写因子とDNA結合の相互作用を通して転写制御をモニターすることでゲノムとプロテオームとの間の関連を同定します。ChIPアッセイの強みは、特定のタンパク質のスナップショットを捉えるその能力、そして系の中で起きるDNA 相互作用と、定量的PCR（qPCR）用いた相互作用の定量です。
クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイは、エピジェネティック修飾と特異的調節タンパク質が結合するゲノムDNA配列 を解析するための強力な方法です。
クロマチンIP実験は様々なプロテオミクスと、架橋、細胞溶解（タンパク質-DNA抽出）、核酸切断、抗体ベースの免疫沈降法、DNAサンプルクリーンアップ、PCRなどの分子生物学の手法を必要とします。ゲル電気泳動のような追加的な技術は、特定のステップを確認する最適化で使用されます。
クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイは、タンパク質-DNA複合体の共有結合的な安定で始まります。多くのタンパク質-DNA相互作用は一過性で、生物学的機能を組織化する多タンパク質複合体 が関与します。In vivo架橋は共有結合的にタンパク質-DNA複合体を安定化します。
In vivo 架橋は従来ホルムアルデヒドを用いていましたが、EGSとDSGのような他の架橋剤でも結合できます。ホルムアルデヒド架橋は直接相互作用する2分子に最適です。しかし、ホルムアルデヒドは長さが0の架橋剤なので、機能性が限定されます。より高次元の相互作用では、longer crosslinkers EGS (16.1Å)やDSG (7.7Å)などの長い架橋剤が、複雑な4次構造を持つ大きなタンパク質複合体を捉えることができます。
研究者はタンパク質-DNA相互作用パートナーを捉えるため、架橋剤の組み合わせをよく使います。これらの架橋剤は無傷の細胞に直接浸透し、効率的にタンパク質-DNA複合体を一緒に固定し、一過性の相互作用複合体までも捉え、分析用に安定化します。
溶解段階では、架橋したタンパク質-DNA複合体を細胞や組織から抽出し、溶液に移します。この段階では、細胞成分は洗剤ベースの溶液で細胞膜を溶解することで遊離しています。タンパク質-DNA相互作用が最初に核分画で起こるので、細胞質タンパク質を取り除くとバックグラウンドが減り、感受性が上がります。界面活性剤や塩の存在はタンパク質-DNA複合体に影響せず、その理由はステップ 1で達成した共有結合的架橋がChIP過程の間ずっと複合体を安定に保つからです。
機械的な細胞溶解は推奨しません。核溶解が不十分になってしまうことがあるからです。Thermo Scientific Pierce Chromatin Prep Moduleのような試薬は、核フラクションを他の細胞成分から分離し、バックグラウンドシグナルを除去して感度を高めるのに使われます。
抽出ステップで全ての核の物質が得られ、結合していない核タンパク質、クロマチンの全長と架橋したタンパク質-DNA複合体などがあります。タンパク質結合配列を解析するためには、抽出したゲノムDNAをより小さな、使用できる断片に切断する必要があります。DNAフラグメンテーションは通常、超音波処理で機械的に、または小球菌ヌクレアーゼ（MNase）を用いて酵素による分解のいずれかで行います。
理想的なクロマチンフラグメントは200 bpから1000 bp未満ですが、DNA切断はコントロールが最も難しいステップの1つです。超音波処理では真にランダムなフラグメントが生じますが、調整が必要な専用の機械の要件があり、超音波処理の間の温度維持の困難さ、長い実施時間、広範囲の最適化ステップなどの制限があります。小球菌ヌクレアーゼによる酵素分解は非常に再現性が高く、複数のサンプル処理を改善できますが、酵素活性の変化により可変性につながったり、酵素がヌクレオソーム間領域に高い親和性を持つ場合があります。
特定の修飾ヒストンを単離するには、目的の転写因子または補助因子、ChIPバリデーション済み抗体が免疫沈降法に使用され、標的を他の核成分から分離します。このステップで選択的に目的タンパク質-DNA複合体を濃縮し、関与しない細胞性物質を排除します。
適切な抗体を選択することは、ChIPアッセイを成功させる重要な要素です。哺乳類のサンプル用には、この手順にバリデーションされた多数のChIPグレード抗体が利用できます。適した抗体がない標的タンパク質用には、HA、 myc、GSTなどの融合タンパク質を生物学的サンプル中に発現させることができ、 そしてアフィニティタグに対し抗体が標的を免疫沈降するために使用されます。
抗体-タンパク質-DNA複合体は、タンパクA、タンパクG、タンパクA/Gで固定化された抗体結合レジンでアフィニティ精製されます。ビオチン化抗体には、固定化されたストレプトアビジンまたは固定化されたThermo Scientific NeutrAvidinタンパク質も使用できます。バックグラウンドを下げるには、抗体結合ビーズを核酸と、サケ精子DNAや一般的なタンパク質源などのタンパク質ブロッキングバッファの組み合わせでブロックすることが必要です。各ChIPサンプルで使われるビーズの容積は、ビーズの容積が増え非特異結合も増えるにつれ、バックグラウンドにも影響することがあります。
目的タンパク質に結合したDNA濃縮は、クロマチン免疫沈降法の最終目的です。DNAレベルはアガロースゲル電気泳動や多くの場合定量的PCR（qPCR）で決定します。クロマチンIPの特定DNA物質が増幅され測定される前に、タンパク質とDNAの間の架橋は反転させる必要があります。これは一般的には広範囲の熱インキュベーション、またはプロテイナーゼKでのタンパク質成分解で得られます。
プロテイナーゼKは脂肪族、芳香族、および疎水性残基のカルボキシ基側を切断します。その幅広い特異性のため、プロテイナーゼKはDNAまたはRNA 調製からタンパク質を除去するために使用されることが多くあります。加えて、プロテイナーゼK分解は精製DNAからヌクレアーゼを除去し、分解を防ぎます。DNAをタンパク質フラグメントから分離するには、フェノール-クロロホルム系が標準のDNA精製方法と一緒に用いられます。または、核酸物質を複雑な生物学的サンプルから精製するために設計されたスピンカラムが使われることもあります。
ChIPの特徴は、定量的PCR（qPCR）で精製DNA物質を定量化する能力です。増幅技術があっても、qPCR手順は十分に正確で、標的のタンパク質-DNAレベルを異なる実験条件で測定できます。免疫沈降された複合体と結合したDNAの量には直接の相関関係があります。
クロマチン免疫沈降（ChIP）
MAGnify™ Chromatin 免疫沈降システムは迅速でさらに再現性のあるソリューションをクロマチン免疫沈降（ChIP）に提供し、目的の抗体に対してChIPを行うために必要なすべての試薬が含まれています。
ChIPアッセイ手順
クロマチン免疫沈降アッセイ（ChIPアッセイ）は、ヒストン修飾（エピジェネティクス）または転写因子とDNA結合の相互作用を通して転写制御をモニターすることでゲノムとプロテオームとの間の関連を同定します。ChIPアッセイの強みは、特定のタンパク質のスナップショットを捉えるその能力、そして系の中で起きるDNA 相互作用と、定量的PCR（qPCR）用いた相互作用の定量です。
クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイは、エピジェネティック修飾と特異的調節タンパク質が結合するゲノムDNA配列 を解析するための強力な方法です。
クロマチンIP実験は様々なプロテオミクスと、架橋、細胞溶解（タンパク質-DNA抽出）、核酸切断、抗体ベースの免疫沈降法、DNAサンプルクリーンアップ、PCRなどの分子生物学の手法を必要とします。ゲル電気泳動のような追加的な技術は、特定のステップを確認する最適化で使用されます。
クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイは、タンパク質-DNA複合体の共有結合的な安定で始まります。多くのタンパク質-DNA相互作用は一過性で、生物学的機能を組織化する多タンパク質複合体 が関与します。In vivo架橋は共有結合的にタンパク質-DNA複合体を安定化します。
In vivo 架橋は従来ホルムアルデヒドを用いていましたが、EGSとDSGのような他の架橋剤でも結合できます。ホルムアルデヒド架橋は直接相互作用する2分子に最適です。しかし、ホルムアルデヒドは長さが0の架橋剤なので、機能性が限定されます。より高次元の相互作用では、longer crosslinkers EGS (16.1Å)やDSG (7.7Å)などの長い架橋剤が、複雑な4次構造を持つ大きなタンパク質複合体を捉えることができます。
研究者はタンパク質-DNA相互作用パートナーを捉えるため、架橋剤の組み合わせをよく使います。これらの架橋剤は無傷の細胞に直接浸透し、効率的にタンパク質-DNA複合体を一緒に固定し、一過性の相互作用複合体までも捉え、分析用に安定化します。
溶解段階では、架橋したタンパク質-DNA複合体を細胞や組織から抽出し、溶液に移します。この段階では、細胞成分は洗剤ベースの溶液で細胞膜を溶解することで遊離しています。タンパク質-DNA相互作用が最初に核分画で起こるので、細胞質タンパク質を取り除くとバックグラウンドが減り、感受性が上がります。界面活性剤や塩の存在はタンパク質-DNA複合体に影響せず、その理由はステップ 1で達成した共有結合的架橋がChIP過程の間ずっと複合体を安定に保つからです。
機械的な細胞溶解は推奨しません。核溶解が不十分になってしまうことがあるからです。Thermo Scientific Pierce Chromatin Prep Moduleのような試薬は、核フラクションを他の細胞成分から分離し、バックグラウンドシグナルを除去して感度を高めるのに使われます。
抽出ステップで全ての核の物質が得られ、結合していない核タンパク質、クロマチンの全長と架橋したタンパク質-DNA複合体などがあります。タンパク質結合配列を解析するためには、抽出したゲノムDNAをより小さな、使用できる断片に切断する必要があります。DNAフラグメンテーションは通常、超音波処理で機械的に、または小球菌ヌクレアーゼ（MNase）を用いて酵素による分解のいずれかで行います。
理想的なクロマチンフラグメントは200 bpから1000 bp未満ですが、DNA切断はコントロールが最も難しいステップの1つです。超音波処理では真にランダムなフラグメントが生じますが、調整が必要な専用の機械の要件があり、超音波処理の間の温度維持の困難さ、長い実施時間、広範囲の最適化ステップなどの制限があります。小球菌ヌクレアーゼによる酵素分解は非常に再現性が高く、複数のサンプル処理を改善できますが、酵素活性の変化により可変性につながったり、酵素がヌクレオソーム間領域に高い親和性を持つ場合があります。
特定の修飾ヒストンを単離するには、目的の転写因子または補助因子、ChIPバリデーション済み抗体が免疫沈降法に使用され、標的を他の核成分から分離します。このステップで選択的に目的タンパク質-DNA複合体を濃縮し、関与しない細胞性物質を排除します。
適切な抗体を選択することは、ChIPアッセイを成功させる重要な要素です。哺乳類のサンプル用には、この手順にバリデーションされた多数のChIPグレード抗体が利用できます。適した抗体がない標的タンパク質用には、HA、 myc、GSTなどの融合タンパク質を生物学的サンプル中に発現させることができ、 そしてアフィニティタグに対し抗体が標的を免疫沈降するために使用されます。
抗体-タンパク質-DNA複合体は、タンパクA、タンパクG、タンパクA/Gで固定化された抗体結合レジンでアフィニティ精製されます。ビオチン化抗体には、固定化されたストレプトアビジンまたは固定化されたThermo Scientific NeutrAvidinタンパク質も使用できます。バックグラウンドを下げるには、抗体結合ビーズを核酸と、サケ精子DNAや一般的なタンパク質源などのタンパク質ブロッキングバッファの組み合わせでブロックすることが必要です。各ChIPサンプルで使われるビーズの容積は、ビーズの容積が増え非特異結合も増えるにつれ、バックグラウンドにも影響することがあります。
目的タンパク質に結合したDNA濃縮は、クロマチン免疫沈降法の最終目的です。DNAレベルはアガロースゲル電気泳動や多くの場合定量的PCR（qPCR）で決定します。クロマチンIPの特定DNA物質が増幅され測定される前に、タンパク質とDNAの間の架橋は反転させる必要があります。これは一般的には広範囲の熱インキュベーション、またはプロテイナーゼKでのタンパク質成分解で得られます。
プロテイナーゼKは脂肪族、芳香族、および疎水性残基のカルボキシ基側を切断します。その幅広い特異性のため、プロテイナーゼKはDNAまたはRNA 調製からタンパク質を除去するために使用されることが多くあります。加えて、プロテイナーゼK分解は精製DNAからヌクレアーゼを除去し、分解を防ぎます。DNAをタンパク質フラグメントから分離するには、フェノール-クロロホルム系が標準のDNA精製方法と一緒に用いられます。または、核酸物質を複雑な生物学的サンプルから精製するために設計されたスピンカラムが使われることもあります。
ChIPの特徴は、定量的PCR（qPCR）で精製DNA物質を定量化する能力です。増幅技術があっても、qPCR手順は十分に正確で、標的のタンパク質-DNAレベルを異なる実験条件で測定できます。免疫沈降された複合体と結合したDNAの量には直接の相関関係があります。
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.