Dynabeads®免疫沈降架橋プロトコル

以下に示すプロトコルでは、架橋剤BS³を使用して、次のプロテイン（各50 µl ）へIgG（5 µg）を架橋します：Dynabeads® Protein A、Dynabeads® Protein G、Immunoprecipitation Kit Protein A、Immunoprecipitation Kit Protein G。架橋剤BSは、生理学的pHで不可逆的架橋（安定アミド結合）をもたらす水溶性の架橋剤です。この免疫沈降架橋プロトコルは、必要に応じてスケールアップおよびスケールダウンが可能です。

1. 結合バッファ（原液）中で、100 mMのBS³を調製します。次に、結合バッファ（サンプルあたりの必要量：250 µl）中で希釈させて5 mMの溶液を作成します。
   注意：BS³原液と結合溶液は、使用直前に作成した新鮮な状態でご使用ください。
2. 200μlの結合バッファ中で、Ig結合のDynabeads Protein AまたはDynabeads Protein Gを2回洗浄します。磁石上に置いて、上清を捨てます。
3. 250 μl、5 mMのBS³中で、Dynabeadsを再懸濁させます。
4. 傾斜/回転させながら、室温で30分間インキュベートします。
5. 12.5 μlのクエンチングバッファを添加して、架橋反応をクエンチします。
6. 傾斜/回転させながら、室温で15分間インキュベートします。
7. 200 μlのPBST（または所望のIPバッファ）で、架橋されたDynabeadsを3回洗浄します。磁石上に置いて、上清を捨てます。
8. IPおよび抗原の溶出工程へ進みます（免疫沈降プロトコルのステップ2.3から開始）。

BS³結合バッファ：20mM リン酸ナトリウム、0.15MのNaCl（pH値7～9）
BS³クエンチングバッファ：1M トリスHCl（pH値7.5）

架橋試薬：Bis（スルホスクシンイミジル）スベリン酸塩（BS3）、f.ex.カタログ番号：21580（Thermo Fisher Scientific社製）