ヒントとコツ

ゲルローディング用のチップを使用すると、より良い操作性が得られます。これらのチップはより薄く、ウェルの奥にチップを挿入できるため、サンプルのオーバーフローを防ぐことができます。

操作性に優れたゲルをお探しですか？Invitrogen Novex WedgeWell Tris-Glycine Gelsおススメです。WedgeWellフォーマットのゲルは、標準的なピペットチップで最大60 μLのサンプルをロードでき、特殊なチップは必要ありません。

ゲルからメンブレンにタンパク質を効率良く溶出させるためには、転写バッファーに0.01～0.05%のSDSを加えます。

より効率の良い方法をお探しですか？150 kDa以上の高分子量タンパク質でも最適な分離を得られるようにデザインしたInvitrogen NuPAGE Tris-Acetate Protein Gelと、高分子量タンパク質を7分間で効率良く転写するInvitrogen iBlot 2 Gel Transfer Deviceをご利用ください。

より良い結果を得るために、ブロッキングバッファーをろ過してみてください。乾燥したミルクを用いたブロッキングバッファーは完全に溶解しないことがあり、検出を妨害する場合があります。

もっと簡単に何か試したいですか？Thermo Scientific Pierce Clear Milk Blocking Bufferは、干渉の原因となるミルク粉を含まないバッファーです。

精製した一次抗体ではなく抗血清を使用すると、バックグラウンドが高くなる場合があります。ターゲットタンパク質を含まないライセートを使用して洗浄します。100 μLのライセートを抗血清に添加し、4℃で一晩インキュベートします。

別のアプローチ—Thermo Scientific SuperSignal Western Blot Enhancerをご利用ください。非特異的結合を防ぎ、シグナル強度と感度が向上するので、より良い結果が得られます。

化学発光によって複数のターゲットを検出しますか？

2つ以上の一次抗体でブロットをインキュベートすると、同じブロット上で2つ以上のターゲットを検出できます。これは、ターゲットタンパク質の分子量が異なっていて、電気泳動条件が互いのターゲットを分離できるように最適化されている場合に有効です。

より良い方法をお探しですか？ Invitrogen Alexa Fluor Plus 二次抗体を使用して、蛍光検出を行えば、マルチプレックス検出が可能です。

一次抗体を再利用しますか？

細菌などの増殖を防ぐために、抗菌剤を必ず加えてください。HRP検出を行う場合は、アジ化ナトリウムの使用は避けてください。最大0.1%のKathon ™やProClin ™防腐剤などを抗菌剤として利用できます。一次抗体の再利用は3回以内にしてください。

さらに簡単な方法は？Invitrogen iBind Western Systemは、ウェスタン解析のブロッキングから二次抗体反応の洗浄までのプロセスを自動化したシステムで、一次抗体の使用量を節約することができます。最良の結果を得るには、毎回同じ量の新しい一次抗体を使用してください。

洗浄バッファーおよびブロッキングバッファーに、最大0.05%のTween 20、Triton X-100、またはNP-40界面活性剤入りのバッファーを使用してみてください。

別のアプローチ—界面活性剤を含む調製済みの Thermo Scientific blocking buffersをご利用ください。

10 mLの二次抗体反応液につき、1 μLのStrep-Tactin conjugateを加えてください。 Thermo Scientific PageRuler unstained protein ladders（製品番号26614、26630、26632、26637）をX線フィルムまたはイメージング装置で検出できます。

より良い方法をお探しですか？—Invitrogen iBright Prestained Protein Ladder（カタログ番号LC5615）を使用して、化学発光検出と蛍光検出の両方を行うことができます。

最大20%のメタノールをバッファー添加し、メンブレンへのペプチドの結合を促進します。0.2 μm PVDF 膜を使用して、ペプチドのブロースルーを防ぎます。

より良い方法とは？ゲル電気泳動によるペプチドの最適な分離にはInvitrogen Novex Tricine Gelをおススメします。また、iBlot 2 Gel Transfer Deviceを利用すると、わずか7分でペプチドを効率的に転写できます。

化学発光基質は機能していますか？

暗室で迅速に作業を行ってください。暗室内で、1 μLのHRP標識二次抗体を、基質の反応溶液に加えます。発光が確認されたら、基質が機能しています。そうでない場合は、新しい基質が必要です。

より良い方法とは？Thermo Scientific SuperSignal West Substrateは、信頼できる迅速で再現性のある結果を得ることができます。

メンブレンを洗浄バッファーで5～10分間処理してから、ストリッピングバッファーを加えてください。自家製のストリッピングバッファーを使用し、ブロットを37℃で最大30分間加熱します。

より良い方法とは？ Thermo Scientific Restore PLUS Western Blot Stripping Bufferを使うと、室温下でわずか10分で効率的にストリッピングができます。

ブロモフェノールブルーを含むサンプルバッファーは蛍光を発し、バックグランドを上昇させる場合があります。ブロモフェノールブルーを含むサンプルバッファーを使用する場合は、バックグラウンドの蛍光シグナルを抑えるために、ブロモフェノールブルー色素の先端をゲルから流出させるか、転写後に色素を含む部分をメンブレンから切除してください。

より良い方法とは？Invitrogen Fluorescent Compatible Sample Bufferなど、ブロモフェノールブルーを含まないバッファーの使用を検討してください。

バックグラウンドノイズを低減し、隣接レーンへの影響を抑えたいですか？

ゲルにロードする分子量マーカーの量を減らしてください。マルチカラーマーカーは個別のチャンネルに表示されるため、シングルカラーの着色済み分子量マーカーを使用します。

より良い方法とは？Invitrogen iBright Prestained Protein Ladderはウェスタンブロッティング用にデザインしたシングルカラーの着色済みマーカーです。可視(着色)・化学発光検出・蛍光検出用のバンドを提供します。通常、2～4 μLで十分です。

メンブレンの性質はバックグラウンドに影響を与える可能性があります。特にPVDF膜は自家蛍光によりバックグランドが高くなるため、蛍光検出用のPVDF膜をご使用ください。また、多くのインク塗料は蛍光を発する可能性があるため、メンブレンにペンは使用しないでください。代わりに鉛筆を使用してください。

より良い方法とは？ Invitrogen Nitrocellulose/Filter Paper Sandwichと Thermo Scientific Low-Fluorescence PVDF Transfer Membraneは、高いバックグランドの問題の解決法のひとつです。

メンブレンは、ゴム手袋をはめた手で処理し、きれいなピンセットでメンブレンの端をつまむようにしてください。また、微粒子や汚染物質がメンブレンに付着するのを防ぐために、高品質のフィルター付きブロッキングバッファーのみを使用してください。

より良い方法とは？交差反応を低減し、高いSN比が得られるようデザインされた Thermo Scientific Blocker FL Fluorescent Blocking Buffer の使用を検討してください。バックグラウンド蛍光が高くなる可能性があるため、ブロッキングバッファーに界面活性剤を加えないでください。

哺乳類サンプルでの蛍光検出に問題がありますか？

バックグラウンドを抑え高いSN比を得るためには、Salmon serumのような非哺乳類のブロッキングバッファーを使用してください。

より良い方法とは？蛍光検出用のThermo Scientific SEA BLOCK Blocking Buffeをお試しください。スチールヘッドサーモン血清から作られたSEA BLOCK Blocking Bufferは、哺乳類サンプルを用いたウェスタン解析の蛍光検出のブロッキング剤として特に有用です。

より十分なシグナルを得るために露光時間を長くしてください。

より良い方法とは？ウェスタンブロッティングの撮影にInvitrogen iBright FL Imaging Systemを使うと、簡単に最適な画像を取得できます。iBright FL Imaging SystemのSmart Exposure機能は、最適な露光時間を素早く判定し、過剰露光や露光不足を最小限にします。

従来のストリッピングバッファーは、低親和性の抗体の除去には有効ですが、二次抗体は残り、リプローブ後のターゲットシグナルの感度が低下する可能性があります。蛍光ウェスタン解析に最適なストリッピングバッファーを選択してください。

より良い方法とは？Thermo Scientific Restore Fluorescent Western Blot Stripping Bufferは、一次抗体と近赤外（IR）蛍光標識二次抗体を迅速に除去するようにデザインされたバッファーです。このストリッピングバッファーは、 low-fluorescence PVDF membrane 膜専用です。