SeqStudio Flexジェネティックアナライザ

Amplification of DNA sequences by polymerase chain reaction (PCR) remains the workhorse for almost all aspects of molecular biology and genomic research.  There is an increasing need to analyze many targets in a single sample.  However, this can be tedious by PCR, involving setting up individual reactions for each of the desired targets.  Methods that can analyze multiple sequences from a single sample would simplify workflows and conserve precious samples.  One method to address this is fragment analysis by capillary electrophoresis (CE).  CE separates amplicons based on both size and fluor in a single capillary allowing a very large number of targets to be analyzed within a single sample.  

Multiplexed PCR coupled with fragment analysis presents a tremendous opportunity to perform complex analyses with minimal expense or effort.  Experiments are limited only by the ability to design primer sets against the targets of interest.  It can therefore be adapted and utilized in nearly any scenario where detection of many target sequences in a single sample is desired.  

This example demonstrates the power of multiplexed PCR by fragment analysis using a custom panel for detecting respiratory viral pathogens.  A panel of PCR primers containing 6-FAM labeling at the 5’-end were designed to detect 12 different respiratory RNA viruses, including rhinovirus, RSV-B, influenza A H1, influenza A H3, influenza B, coronavirus HKU1, coronavirus NL63, coronavirus OC43, and coronavirus 229E, as well as SARS-CoV-2 S, N, and orf1ab, so that each organism generated a different sized amplicon.  The resulting amplicons could be separated and examined using the SeqStudio, SeqStudio 24 Flex, or 3500xL genetic analyzers.

多くの場合、ゲノム解析を開始する前、あるいは次のステップに進む前に、二本鎖DNA（dsDNA）のスタートするプールの品質チェック（QC）を行う必要があります。例えば、FFPE保存組織から抽出されたDNAは断片化していて小さすぎるため、有用な情報が得られない場合があるので、作業を進める前に全体のサイズを把握しておくと役立ちます。

SeqStudio FlexジェネティックアナライザでdsDNA断片のサイズと相対量を解析することができます。プロトコルでは、蛍光DNAが挿入されている色素であるTOTO-1をサンプルとインキュベートします。このサンプルは、キャピラリーヒーターをオフにした状態でPOP7ポリマーを通過します。（これにより、DNAは大部分が二本鎖の非変性状態に保たれます。）テストフラグメントの泳動結果と既知のdsDNAスタンダードの泳動結果を比較することで、テストフラグメントのサイズを決定することができます。

このテストでは、SeqStudio Flex Genetic Analyzerと3500xL Genetic Analyzerの性能を、図に示す2種類の既知dsDNAスタンダードサンプルを含む数種類のDNAサンプルの解析で評価しました。パネルAは、HindIIIで消化されたファージラムダDNAの解析を示し、23,130～125 bpの8個のフラグメントのよく知られたパターンを示しています。パネルBは、同じラムダHindIII消化物とBsuRIで消化されたファージphiX174の混合物を示しています。8つのラムダフラグメントに加えて、1,353～72 bpの10個のフラグメントが検出されました。SeqStudio Flex（左）と3500xL（右）で得られたプロファイルは非常によく似ており、3500シリーズと比較しても新しい装置が有効であることが示されました。

研究によっては、ゲノムの特定領域にフォーカスした配列情報が必要です。NGSのようなゲノムワイドな探索ツールは、非常に広い領域で膨大な量のデータを提供しますが、このような複雑なアプローチは、焦点を絞った研究に必ずしも必要とされるわけではありません。サンガーシーケンスは、ゲノム領域のゴールドスタンダードシーケンスのための、シンプルで費用対効果が高く、解釈しやすいソリューションを提供します。 

焦点を絞ったシーケンスを実証するために、SARS-CoV-2 Spike遺伝子全体の12ペアのシーケンスプライマーを特定した以前の研究に基づいて、Spikeタンパク質と隣接配列を含SARS-CoV-2ゲノムの領域をシーケンスしました。12の重複するアンプリコンでカバーされるSARS-CoV-2のSpike遺伝子領域は、5 kbを超えます。

図のパネルAでは、図に示すように、ほぼすべての12アンプリコンから高品質のサンガーシーケンス結果（水色のバーの高さで表示）が得られました。

これらの結果は、SARS-CoV-2 Spike遺伝子の単一のコンティグリードにアセンブルされました。リード品質の測定基準は、3つのアナライザーすべてでほぼ同じでした。ここで示すように、一貫したベースコール品質により、サンガーシーケンスは、重複する中長アンプリコンを使用してフォーカス領域のシーケンスをアセンブルし、対象の遺伝子座をカバーするコンティグを生成することができます。