Sanger Sequencing_SARS-CoV-2_research

特異性の高いターゲット結果を生成

精度が99%を超え、ロングリードが可能なサンガーシーケンシングは、ゴールドスタンダードのシーケンシング技術です。さらに、キャピラリー電気泳動（CE）によるフラグメント解析では、DNAサイジング、相対定量、ジェノタイピングに関する情報が得られます。当社のシンプルなワークフローにより、サンガーシーケンシングおよびフラグメント解析は、サンプルから結果取得までを1日以内に終えることができ、SARS-CoV-2（COVID-19を引き起こすコロナウイルス）の研究を迅速かつコスト効率の高いものにすることができます。

SARS-CoV-2研究にサンガーシーケンシングを使用するのはなぜですか？

サンガーシーケンシングは、ラボの手法を補完し、より効率的な研究につながります。
  • 1977年に開発されて以来、サンガーシーケンシングは、過去40年間で最も広く使用されているDNAシーケンシング法であり、世界中で広く利用されています
  • サンガー法は、小規模なプロジェクトや NGS 結果の確認に幅広く使用されています
  • より具体的な目的を持った小規模な調査は、より焦点を絞った、より安価なラボ手順からメリットを得られます
サンガーシーケンシングの利点

サンガーシーケンシングは、単一遺伝子のシーケンシング、遺伝子変異の確認、反復配列の検出、コピー数多型、および一塩基変異の検出のゴールドスタンダードです。サンガーシーケンシングは以下の用途に最適です。

  • 単一遺伝子および単一ヌクレオチドバリアントのシーケンシング
  • 100アンプリコン以下のターゲットシーケンシング
  • バーコードを使用せずに、一度に最大96個のサンプルをシーケンシング
  • NGSの確認
  • GCリッチな配列
  • 微生物の同定
  • マイクロサテライト解析トまたはSTR解析
  • プラスミドシーケンシング

詳細はこちら：
サンガーシーケンシングまたはNGS？

NGS技術はスループット性能が高いため、研究ラボでは一般的ですが、サンガーシーケンシングは研究ニーズに適したコスト効率の高いソリューションを提供します。 高価な装置を必要とせず、一部のNGS技術では高いゲノムカバレッジを得られない低力価のウイルスサンプルでも高品質のデータを生成できます。

サンガーシーケンシングとフラグメント解析は、どのようにしてSARS-COV-2研究に使用できますか？

Sanger_sequencing_SARS-CoV-2 identification

SARS-CoV-2を理解し、将来の治療オプションを迅速に特定し、可能性のあるワクチンターゲットを開発するために、当社のサンガーシーケンシングおよびフラグメント解析研究ソリューションの包括的なポートフォリオは、お客様の研究を前進させるためのお手伝いをさせていただきます。

大量のサンプルを迅速かつ正確に処理する必要がある大流行の状況では、サンガーシーケンシングとフラグメント解析は、迅速に結果を得るのに非常に役立ちます。

ウイルスの同定

SARS-CoV-2の発生当初、いくつかの研究室でサンガーシーケンシングを使用し、原因病原体がSARS-CoV-2であることが確認されました1-4。さらに、これらのゲノムを解析し、他の既知のコロナウイルスと比較することにより、このウイルスは中間動物宿主と思われるコウモリから進化した病原体保有動物に由来する可能性が高いことが明らかになりました5,6.

Sanger_sequencing_virus_research
堅牢でコスト効率の高いサンガーシーケンシングおよびフラグメント解析により、以下のことが可能になります。
  • SARS-CoV-2を迅速に同定し、他の呼吸器系ウイルスと識別できます1-3
  • ギャップ充填とアセンブリ配列を生成して、全ゲノム NGS ウイルスシーケンシングをサポートします1-6
  • 全ゲノムNGSデータから同定された配列の変動を確認します7
  • ウイルス量の少ないサンプルには、全ゲノムシーケンシングにネステッドPCRアプローチを利用します8

サンガーシーケンシングとフラグメント解析は他に何ができますか？

RT-PCR／qPCRの結果確認複数のターゲットを迅速にテストできます
サンガーシーケンシングは、RT-PCR／qPCR の結果を確認し、SARS-CoV-2を他の呼吸器病原体と確実に識別するために使用されています。簡易ワークフローでは、PCR産物を精製し、シーケンシングプライマーをターゲット領域内の既知の配列に結合させることで、キャピラリー電気泳動（CE）を用いたシーケンスに展開することができます1,3。マルチプレックスqPCRソリューションは、少数の病原体を検査します。その比較的少ない容量により、多数のターゲットや病原体を検出する必要がある場合にスループットが制限されることがあります。CEによるフラグメント解析は、単一のサンプルで異なる症候群に関連する複数の病原体を検査するのに使用することができます9。例えば、呼吸器マルチプレックスパネルは、ウイルス性および細菌性の病原体を検出し、感染の原因となる一般的な病原体をRule in/out（確定／除外）するのに役立ちます。

フラグメント解析ベースのターゲットマルチプレックスソリューションを用いたSARS-CoV-2ウイルス配列の検出のための簡単な方法については、こちらをご覧ください：

SARS-CoV-2_detection_application
疫学的サーベイランス研究

低コストのサンガーシーケンシングは、NGSで既に配列決定されている遺伝子を含む特定の遺伝子の配列を確認するためのゴールドスタンダードのシーケンシング法と考えられています。以下の用途に使用できます：

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  • 症候性および無症候性サンプルのクラスター内の異なるSARS-CoV-2遺伝子をシーケンシングして、バリアントを確認し10-12、異なる集団間でのこのウイルスの感染パターンと遺伝的進化について特性評価します13, 4 
  • 人畜共通感染の潜在的な原因を理解するうえで重要な さまざまなコロナウイルスの起源と種間の感染を確認します 15-17
  • NGSシーケンシングが利用できない場所での1回限りのサンプルや、ウイルス力価の低いサンプルのための全ウイルスゲノムシーケンシングを実施します8,11

効果的な危機対応には、ウイルスの種類とサブタイプを理解することが不可欠です。また、サーベイランスは、ウイルスの種間伝播およびその空間的広がりを、進化的な時間とヒトと野生生物の接点で理解するうえでも重要な役割を果たします。 モニタリングは、無症候性サンプルなど、症状の程度の異なるサンプルから得られたさまざまなバリアントの存在を検出するのに役立ちます。

SARS-CoV-2の潜在的な早期警戒システム

廃水中のSARS-CoV-2の同定は、ウイルスの拡散に関するほぼリアルタイムの情報を提供し、ウイルスの拡散を監視するための重要なアプローチとなる可能性があります18,19。この方法は廃水ベースの疫学（WBE）として知られており、一般的に感染性疾患の集団発生の早期警戒システムとして機能する可能性があり、近い将来、SARS-CoV-2感染の第2波の予測に役立つ可能性があります。 世界中の複数の研究者がRT-PCRやqPCRによるウイルス同定後、サンガーシーケンシングを用いて、廃水中のSARS-CoV-2の同定を確認しています20-22。

詳細はこちら：廃水中のSARS-CoV-2：潜在的な早期警戒メソッド

SARS-CoV-2感染感受性の変動を理解する上での咽頭マイクロバイオームの役割

研究では、咽頭微生物叢（PM）がさまざまな呼吸器ウイルス感染の感受性に影響を与える可能性があることが示唆されており23,24、SARS-CoV-2の疫学を理解する上で重要な可能性があります。 CEによるフラグメント解析は、さまざまな疾患表現型に関連する微生物のシグネチャを特定するのに使用できます25。これは、細菌の6S-23S rRNA Interspace（IS）領域の増幅に依存しており、細菌種によって長さおよび頻度が異なるPCRフラグメントを生成します。各PCRフラグメントは、分離して遺伝子解析装置で検出することができます。結果として得られたフラグメントパターンは、キュレーションされたデータベースと比較され、サンプルに存在する種が特定されます25。

詳細はこちら：微生物叢の違いでSARS-CoV-2感受性の変動を説明できますか？

ワクチンおよび治療研究

SARS-CoV-2の安全で特異的な抗ウイルス治療法やワクチンの開発が急務とされています。ワクチンは、迅速かつ効果的に反応するように免疫系を訓練することで、感染リスクを低減する長期的なソリューションを提供します。そのため、ワクチンのアプローチを選択し、免疫応答を引き起こす可能性のある病原体および抗原候補を特定するための基礎的なラボ研究から始めることが重要です。

Sanger_sequencung_vaccine_therapeutic_research

サンガーシーケンシング：理想的なアプローチ

シンプルで迅速、コスト効率の高いサンガーシーケンシングワークフローは、ワクチン開発ワークフローのさまざまなステップに最適です：

  • ターゲット探索では、ウイルスとそのバリアントの同定に使用されています
  • タンパク質の発現を最大化するためのmRNAワクチンの配列の最適化に役立ちます26
  • ウイルスに対する反応として産生された中和抗体の配列決定および特性評価に使用することができ、治療や予防に役立つ可能性があります27-29

ヒト細胞株認証の重要性

ワクチン研究は、多くの場合、主要なリポジトリや研究者仲間から得た培養ヒト細胞を用いて行われます。実験で使用された細胞は、推定20～15%の確率で、誤認あるいは別の細胞株とクロスコンタミネーションしています。現在、主要なリポジトリでは細胞株の同一性を認証していますが、多くの研究者は、CEによるショートタンデムリピート（STR）ジェノタイピングなどの標準的なジェノタイピング技術を使用して細胞株の同一性をテストし、認証することをすべての研究者に求めています。

当社は、細胞株同一性を認証するための製品を提供しています：

他の科学者は、感染症研究でサンガーシーケンシングをどのように使用していますか？

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「サンガーシーケンシングは、他の新しいプラットフォームではできないことを実現できます。特に、プラットフォーム全体の上位の一部ではキャプチャできない可能性のある伝染性ウイルス遺伝子からマイナーアレル頻度のハプロタイプを調べたい場合に適しています。」     

Dr. Lillian Seu
Center for Infectious Disease Control, Zambia

ザンビアでのHIV研究において、薬剤耐性変異の検出にサンガーシーケンシングがどのように使用されたかをご覧ください

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「サンガーシーケンシングの高い精度および感度は、点変異の確認、クローニングされたDNAの位置の決定、短い内部ギャップのシーケンシング、またはゲノム末端での欠損データの確認において、何物にも代えがたいものとなっています。」 

Dr. Iryna Goraichuk
USDA-ARS Exotic and Emerging Avian Viral Unit

サンガーシーケンシングによって、新しい鳥ウイルスがどのように発見されたかをご覧ください

シングルカートリッジ・マルチアプリケーション・ジェネティック・アナライザによりSARS-CoV-2の研究結果を迅速に取得できます

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  • サンガーシーケンシングとフラグメント解析の両方のサンプルを同じプレート上で同時に実行します。
  • セットアップ時間を短縮します
  • 卓上スペースを最大限に活用できます
  • Connectを使用すると、いつでもどこからでもデータにアクセス、解析、共有できます

詳細はこちら ›

サンガーシーケンシングワークフロー

当社の簡単で迅速なサンガーシーケンシングワークフローは、サンプルから結果取得までを1日以内に終えることができます。PCR増幅からデータ解析まで、当社が推奨するワークフローの多くのステップをサポートする製品を提供しています。

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フラグメント解析ワークフロー

当社は、簡単なサンプル調製からピーク解析まで、フラグメント解析ワークフローの各ステップを簡素化する幅広い製品およびサービスを提供しています。

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参考文献

サンガー法シーケンシングおよびフラグメント解析プロトコルは、以下の文献に引用されています：

  1. Chan, JFW., et. al.(2020) A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster.Lancet; 395: 514–23 (https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30154-9)
  2. Zhu, N., et. al.(2020) A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019.N Engl J Med 382;8 (https://doi.org/10.1056/nejmoa2001017)
  3. Caly, L., et. al.(2020) Isolation and rapid sharing of the 2019 novel coronavirus (SARS‐CoV‐2) from the first patient diagnosed with COVID‐19 in Australia.Med J Aust 2020; 212 (10): 459-462.(https://doi.org/10.5694/mja2.50569)
  4. Lam, LT., et. al.(2020) “Whole-genome sequencing and de novo assembly of a 2019 novel Coronavirus (sars-cov-2) strain isolated in Vietnam.Preprint at bioRxiv doi: (https://doi.org/10.1101/2020.06.12.149377)
  5. Zhou, P., et. al.(2020) A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin.Nature (579) (https://doi.org/10.1038/s41586-020-2012-7)
  6. Lu R,. et.al.(2020) Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding.Lancet: 395: 565-574 (https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30251-8)
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もっと詳しく知るための資料

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Seq It Outでは、皆様の日常的なサンガーシーケンシングおよびフラグメント解析の疑問にお答えします。

シーケンシングの歴史および研究ニーズに合ったプラットフォームの選び方について学べます。

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.