멀티플렉스 형광 웨스턴 블로팅 | Thermo Fisher Scientific

5 Steps to Multiplexed Fluorescent Western Blotting

멀티플렉스 형광 웨스턴 블로팅은 정확하고 정량적인 결과, 안정적인 신호 및 점점 인기가 높아지고 있는 단일 블랏에서 다수의 단백질 표적을 명확하게 평가할 수 있는 기능을 제공합니다. 웨스턴 블로팅 검출을 위한 다양한 형광 염료 및 항체와 새로운 이미징 시스템을 사용할 수 있는 멀티플렉스 웨스턴 블로팅은 시간을 절약하고 비용을 절감하며 데이터 생성 및 수집의 효율성을 향상시킬 수 있습니다.

여기서 당사는 멀티플렉스 형광 웨스턴 블로팅을 시료 전처리에서 데이터 수집까지 5 단계로 나누어 각 단계를 최적화하고 방해 요소를 피하여 최상의 결과를 얻을 수 있도록 지원합니다.

멀티플렉스 형광 웨스턴 블랏의 5 단계는 다음과 같습니다.

단백질 젤 전기영동을 위한 시료 전처리

웨스턴 블로팅을 위해 사용되는 단백질 시료는 조직, 세포 및 세포구성요소 분획을 비롯한 다양한 소스에서 얻을 수 있습니다. 이러한 소스로부터 단백질을 분리하고 정제하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있습니다.

이는 백그라운드 형광에 기여할 수 있는 오염 물질의 유입을 방지하기 위해 형광 웨스턴 블로팅 실험에 필요한 단백질 시료를 전처리할 때 중요합니다. Bromophenol blue는 이미징 중에 백그라운드 형광에 기여합니다.

아래와 같은 총 단백질 추출 시약 및 키트는 웨스턴 블로팅과 호환되는 추출물을 제공합니다.

시료 유형	목표	권장되는 Thermo Scientific 시약 또는 키트
일차 배양 또는 포유류 세포 또는 조직	총 단백질 추출	M-PER Reagent T-PER Reagent N-PER Reagent RIPA Lysis and Extraction Buffer Pierce IP Lysis Buffer
배양된 포유류 세포 또는 조직	세포구성요소 분획 또는 소기관 분리	NE-PER Reagent Subcellular Fractionation Kits Mitochondria Isolation Kits Pierce Cell Surface Protein Isolation Kit Syn-PER Reagent Lysosomes Enrichment Kit
세균 세포	총 단백질 추출	B-PER Reagent
효모 세포	총 단백질 추출	Y-PER Reagent Y-PER Plus Reagent
곤충 세포(바큘로바이러스)	총 단백질 추출	I-PER Reagent
식물 조직(잎, 줄기, 뿌리, 꽃)	총 단백질 추출	P-PER Reagent

단백질 정량분석

단백질 시료의 농도를 알면 전기영동 단계 중에 젤에 로딩할 적절한 양을 결정하는 데 도움이 됩니다. 시료의 단백질 농도를 측정하는 데 다양한 단백질 어세이를 사용할 수 있습니다. 단백질 어세이 선택 가이드를 사용하여 용도에 적합한 단백질 어세이를 결정할 수 있습니다.

Multiskan Sky 마이크로플레이트 분광광도계

신뢰할 수 있는 단백질 정량 및 분석 외에도 Thermo Scientific Multiskan Sky 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 DNA 및 RNA 분석 및 ELISA와 같은 UV-Vis 측광 연구 애플리케이션을 수행할 수 있습니다. Multiskan Sky 리더로 넓은 파장 범위(200-1000 nm)를 지원하고 경로 길이 보정이 가능하며 판독 속도가 빠릅니다. µDrop 플레이트 옵션으로 미량 분석이 가능합니다. 한 번에 최대 16회의 NanoDrop 측정을 수행하는 것과 같습니다. 직관적인 터치스크린 사용자 인터페이스, 온보드 소프트웨어 및 내장 프로토콜을 통해 장비에서 직접 빠른 측정을 실행할 수 있습니다. 또는 장비 구매 시 당사의 무제한 라이선스와 사용이 간편한 Thermo Scientific SkanIt 소프트웨어를 사용하여 광범위한 이미 만들어진 프로토콜 온라인 라이브러리에 액세스할 수 있습니다.

Multiskan Sky Microplate Spectrophotometer with µDrop plate

데모 요청 견적 요청 자세히 보기

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젤 전기영동을 사용한 분자량 기반 단백질 분리

단백질 젤 전기영동을 사용하여 전처리된 단백질 시료의 분리는 멀티플렉스 형광 웨스턴 블로팅의 두 번째 단계입니다. 단백질 젤 화학 및 폴리아크릴아미드 농도를 신중하게 선택하여 표적 단백질을 서로 효과적으로 분리할 수 있습니다. 더 선명한 밴딩 패턴을 제공하는 데 도움이 되는 폴리아크릴아미드 농도 구배를 제공하는 그래디언트 젤 사용을 고려하십시오.

적합한 단백질 젤 선택

단백질에 적합한 단백질 젤 화학 물질을 선택하면 표적 단백질의 최적 분해능을 얻을 수 있습니다. 당사의 사전 제작 단백질 젤은 4가지 각기 다른 화학 물질로 제공됩니다. 화학 물질 중 어떤 것을 사용할지 여부는 분리 중인 단백질의 존재량, 단백질의 크기에 따라 달라집니다.

단백질에 적합한 젤 찾기
다른 공급업체의 젤에서 변환

최적의 단백질 분해능을 위해 적합한 단백질 젤 및 버퍼를 찾아보십시오.

단백질 시료 유형	젤 화학	프리캐스트 젤	샘플 버퍼*	단백질 래더	러닝 버퍼	트랜스퍼 버퍼
저존재비/번역후 수정됨 광범위 분자량(6–400 kDa)	Bis-Tris	Bolt Bis-Tris Plus(최대 60 μL 로딩)	Fluorescent Compatible Sample Buffer	iBright Prestained Protein Ladder	Bolt MOPS SDS Buffer (15–260 kDa); Bolt MES SDS Buffer (3.5–160 kDa); 환원된 샘플을 위해 Bolt Antioxidant 추가	Bolt Transfer Buffer
저존재비/번역후 수정됨 광범위 분자량(6–400 kDa)	Bis-Tris	NuPAGE Bis-Tris			NuPAGE MOPS SDS Buffer (15–260 kDa); Bolt MES SDS Buffer (3.5–160 kDa); 환원된 샘플을 위해 Bolt Antioxidant 추가	NuPAGE Transfer Buffer
고존재비 광범위 분자량(6–400 kDa)	Tris-glycine	Novex Tris-Glycine WedgeWell format			Novex Tris-Glycine SDS Running Buffer	Novex Tris-Glycine Transfer Buffer
고분자량(40–500 kDa)	Tris-acetate	NuPAGE Tris-Acetate Gels		Spectra Multicolor High Range Protein Ladder	NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer	NuPAGE Transfer Buffer
저분자량(2.5–40 kDa)	Tricine	Novex Tricine Mini Gels		Spectra Multicolor Low Range Protein Ladder	Novex Tricing SDS Running Buffer	Novex Tris-Glycine Transfer Buffer
* 시료를 70°C에서 10분간 가열

샘플 버퍼

Bromophenol blue를 함유한 샘플 버퍼는 형광을 발하여 백그라운드 증가에 기여할 수 있습니다. Bromophenol blue를 함유한 샘플 버퍼를 사용하는 경우, 백그라운드 형광 신호를 피하기 위해 염료 전면을 트랜스퍼 전에 젤로부터 제거하거나 트랜스퍼 후에 멤브레인으로부터 절단할 수 있습니다.

Invitrogen Fluorescent Compatible Sample Buffer(카탈로그 No. LC2570)과 같이 Bromophenol blue를 함유하지 않은 형광 호환 샘플 버퍼의 사용을 고려하십시오.

단백질 래더(Protein ladders)

iBright 사전 염색 단백질 래더는 중간 범위 분자량 단백질의 멀티플렉스 형광 웨스턴 블로팅을 위한 분자량 마커로 사용하는 것이 좋습니다. 전기영동 중에 단백질 밴드를 직접 시각화할 수 있으며 다음과 같은 특징이 있습니다.

가시광선과 화학 발광 및 형광 검출 방법으로 나타나는 iBright 사전 염색 단백질 래더

직접 및 근적외선 형광 시각화를 가능하게 하는 형광단이 라벨링되어 있는 파란색으로 염색된 10개의 단백질
화학 발광 또는 형광 검출을 직접 가시화할 수 있는 두 개의 비염색 단백질(30 kDa 및 80 kDa)

표준 사전 염색 분자량 마커를 사용할 수 있지만 마커에 형광 밴드가 포함되어 있으면 과부하가 백그라운드 형광을 증가시키고 인접 레인으로의 신호 블리드를 증가시킬 수 있으므로 로딩량을 최적화해야 합니다. iBright 사전 염색 단백질 래더를 사용하면 젤에 로드되는 분자량 마커의 양을 줄일 수 있습니다. 일반적으로 시각화 및 형광 검출에는 2-4 μL이면 충분합니다.

iBright Prestained Protein Ladder에 대해 자세히 알아보기

단백질 젤 웰컴 팩

단백질 젤 웰컴 팩은 멀티플렉스 형광 웨스턴 블로팅 실험에서 Invitrogen 프리캐스트 단백질 젤 사용을 시작하기 위한 경제적인 방법입니다. 단백질 젤 웰컴 팩은 단백질 젤 화학 물질 각각에 사용할 수 있으며 프리캐스트 단백질 미니 또는 미디 젤, 버퍼, 래더, 미니 젤 탱크 또는 SureLock 탠덤 미디 젤 탱크와 함께 제공되므로 개별 부품 비용을 크게 절감할 수 있습니다. iBright 사전 염색 단백질 래더 및 Invitrogen 형광 호환 샘플 버퍼(카탈로그 번호 LC2570)은 단백질 젤 웰컴 팩에 포함되지 않으며 별도로 주문해야 합니다.

단백질 젤 웰컴 팩에 대해 자세히 알아보기

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단백질 젤 가이드 다운로드

단백질 젤 전기영동 기술 핸드북 다운로드

웨비나: 연구 애플리케이션에 적합한 단백질 젤 선택

젤 매트릭스에서 고체 지지 멤브레인으로 단백질 트랜스퍼

전기영동 후 폴리아크릴아미드 젤에서 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 단백질을 효율적으로 트랜스퍼하는 것은 면역검출 기법을 사용하여 특정 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블로팅에서 중요한 단계입니다.

젤 트랜스퍼 전기영동 방법은 습식 트랜스퍼, 세미-드라이 트랜스퍼 및 드라이 트랜스퍼로 분류할 수 있습니다.

아래 선택 표를 사용하여 트랜스퍼 방법과 필요한 장비, 버퍼 및 시간 요구 사항을 비교해 보십시오.

	습식 트랜스퍼			세미-드라이 트랜스퍼	드라이 트랜스퍼
	Mini Blot Module	XCell II Blot Module	SureLock Tandem Midi Blot Module	Power Blotter Systems	iBlot 3 Western Blot Transfer System
용량	블랏 모듈당 미니 젤 1개, 탱크당 블랏 모듈 1–2개	최대 2개의 미니 블랏	블랏 모듈당 미디 젤 1개, 탱크당 블랏 모듈 1–2개	미니 젤 1–4개 또는 미디 젤 1–2개	미디 젤 1-2개 또는 미니 젤 1-4개
트랜스퍼 시간	60분	60–120분	30분	7–10분	3분 미만
블로팅 영역(cm)	9 x 9	9 x 9	9.2 x 14.4	10 x 18 또는 21 x 22.5	8.5 x 13.5
트랜스퍼 버퍼 볼륨	블랏 모듈당 220 mL	200 mL	블롯 모듈당 300 mL	사전 절단 멤브레인 & 필터: 50–100 mL, Select 트랜스퍼 스택: 버퍼 불필요	버퍼 불필요
전원 공급	외부	외부	외부	내부	내부
필요한 장비	Mini Gel Tank: 최대 2개의 미니 블랏 모듈을 수용할 수 있는 용량	XCell SureLock Mini-Cell	SureLock Tandem Midi Gel Tank	—	—
	자세히 알아보기	자세히 알아보기	자세히 알아보기	자세히 알아보기	자세히 알아보기

동영상: iBlot 3 웨스턴 블로팅 트랜스퍼 시스템으로 단백질 젤 트랜스퍼를 수행하는 것이 얼마나 쉬운지 확인하십시오.

트랜스퍼 멤브레인

백그라운드 형광의 주요 소스를 제거하려면 니트로셀룰로오스를 비롯한 자가형광 특성이 낮은 멤브레인과 Thermo Scientific 니트로셀룰로오스 멤브레인(카탈로그 번호 88018) 및 저형광 PVDF 트랜스퍼 멤브레인(카탈로그 번호 22860)과 같은 특수 저형광 PVDF 멤브레인을 사용하십시오. 백그라운드 형광 및 아티팩트에 영향을 줄 수 있는 멤브레인의 오염 및 스크래치를 제한하기 위해 장갑을 낀 손과 깨끗한 무딘 핀셋으로만 멤브레인을 다루십시오.

도움말: 멤브레인에 펜을 사용하지 마십시오. 많은 잉크가 형광을 발합니다. 대신 연필을 사용하십시오.

트랜스퍼 버퍼

아래 표를 사용하여 사용 중인 단백질 젤에 맞는 올바른 트랜스퍼 버퍼를 확인하십시오.

단백질 시료 유형	젤 화학	프리캐스트 젤	트랜스퍼 버퍼
저존재비/번역 후 수정됨 광범위 분자량(6–400 kDa)	Bis-Tris	Bolt Bis-Tris Plus(최대 60 μL 로딩)	Bolt Transfer Buffer
저존재비/번역 후 수정됨 광범위 분자량(6–400 kDa)	Bis-Tris	NuPAGE Bis-Tris	NuPAGE Transfer Buffer
고존재비 광범위 분자량(6–400 kDa)	Tris-glycine	Novex Tris-Glycine WedgeWell 형식	Novex Tris-Glycine Transfer Buffer
고분자량(40–500 kDa)	Tris-acetate	NuPAGE Tris-Acetate Gels	NuPAGE Transfer Buffer
저분자량(2.5–40 kDa)	Tricine	Novex Tricine Mini Gels	Novex Tris-Glycine Transfer Buffer

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Thermo Scientific Power Blotter 브로셔 커버 이미지

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HMW 단백질 트랜스퍼 애플리케이션 노트 다운로드

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형광 라벨링 항체를 사용한 트랜스퍼 단백질 검출

성공적인 멀티플렉스 형광 웨스턴 블로팅을 위해서는 항체 및 형광 라벨의 신중한 선택이 필요합니다. 애플리케이션 노트 다운로드: 항체 및 형광 라벨 선택에 대한 광범위한 논의를 위한 형광 웨스턴 블로팅 - 멀티플렉스를 위한 가이드

형광 라벨 선택

광학적으로 뚜렷한 스펙트럼을 가진 형광단을 선택하여 교차 채널 형광을 방지하십시오. 뚜렷한 여기(excitation) 스펙트럼 및 방출(emission) 스펙트럼을 위한 멀티플렉스 실험을 위해 선택된 형광단의 예는 아래 그림 1과 2에 나와 있습니다. 1 ~ 4프로브 멀티플렉스 웨스턴 실험에서 iBright FL1500 이미징 시스템과 함께 사용할 수 있는 멀티플렉스 형광단 조합의 예는 표 1을 참조하십시오.

표 1. iBright FL 이미징 시스템을 사용한 성공적인 멀티플렉스 분석을 위한 형광단 조합의 예.

타겟 개수	콘주게이트 1	콘주게이트 2	콘주게이트 3	콘주게이트 4
1	Alexa Fluor Plus 647
2	Alexa Fluor Plus 647	Alexa Fluor 546
3	Alexa Fluor Plus 647	Alexa Fluor 546	Alexa Fluor Plus 488
4	Alexa Fluor Plus 647	Alexa Fluor 546	Alexa Fluor Plus 488	Alexa Fluor Plus 800

그림 1. 특별히 선택된 여기(excitation) 스펙트럼이 뚜렷한 형광단을 사용한 멀티플렉스 실험의 예. Fluorescence SpectraViewer에서 생성된 이 예에서 Alexa Fluor Plus 488 및 Alexa Fluor 546 형광단의 여기(excitation) 스펙트럼(파선)은 여기 필터 범위 내에서 최소한의 중첩을 갖습니다. 두 형광단이 방출 필터 범위 내에 방출(emission) 스펙트럼(실선)의 일부를 갖지만 Alexa Fluor 546은 Alexa Fluor Plus 488에 대해 선택된 여기(excitation) 필터에 의해 여기되지 않기 때문에 방출 필터를 통과하기 위해 존재하는 Alexa Fluor 546의 형광은 없습니다.

특별히 선택된 방출 스펙트럼이 뚜렷한 형광단을 사용한 멀티플렉스 실험의 예

그림 2. 특별히 선택된 방출(emission) 스펙트럼이 뚜렷한 형광단을 사용한 멀티플렉스 실험의 예. Fluorescence SpectraViewer에서 생성된 이 예에서 Alexa Fluor Plus 680 및 Alexa Fluor 790의 방출(emission) 스펙트럼(실선)은 두 개의 방출 필터 범위 내에서 중첩되지 않습니다. 두 형광단 모두 여기 필터 1 범위 내에서 여기 스펙트럼(파선)의 일부를 가지고 있음에도 불구하고 해당 여기 범위에서 생성된 Alexa Fluor 790 형광은 방출 필터 1을 통과할 수 있는 파장 내에 있지 않으므로 Alexa Fluor 790의 형광이 해당 채널의 카메라 검출기에 도달할 수 없습니다.

Alexa Fluor Plus 2차 항체

형광 웨스턴 블로팅으로 희귀하거나 귀중한 시료에서 미량의 표적을 검출하고 시각화해야 합니까?

기존 Alexa Fluor 2차 항체와 비교:

높은 신호 대 잡음비
낮은 교차 반응성

자세히 알아보기

특정 항체 검색

아래 검색 도구를 사용하여 관심 있는 항체를 찾아 보십시오. 그런 다음, 표적 또는 숙주 종, 단클론 또는 다클론 항체 유형, 애플리케이션 및 기타 조건으로 결과를 필터링할 수 있습니다.

지금 찾아보기

검출 프로세스의 자동화

Invitrogen iBind 및 iBind Flex Western 장치를 사용하여 모든 블로킹, 항체 인큐베이션 및 세척 단계를 자동화할 수 있습니다. thermofisher.com/ibind에서 자세히 알아보십시오.

문제 해결

문제	가능한 원인	솔루션
신호가 약하거나 없음	1차 항체 양이 부족함	1차 항체 농도를 높입니다. 1차 항체의 역가가 충분하고 검출할 항원에 특이적인지 확인합니다. 인큐베이션 시간을 4°C에서 밤새도록, 또는 실온에서 3-6시간으로 연장합니다. 항체 강화제를 사용해 봅니다.
	항체 활성 손실	항체가 적절히 보관되었는지 확인합니다. 항체의 만료 날짜를 확인합니다. 사전 희석된 항체를 여러 번 사용하지 마십시오.
	이미징 노출 시간이 너무 짧음	노출 시간을 늘립니다. iBright FL1500 시스템에서 스마트 노출 기능을 사용하거나 다른 기기에서 유사한 자동 노출 기능을 사용합니다.
	잘못된 장비 설정	의도한 형광단에 대해 올바른 여기 및 방출 범위가 선택되었는지 확인합니다.
	계면활성제 사용	계면활성제가 너무 많거나 계면활성제의 특성으로 인해 신호가 씻겨 나갈 수 있습니다(계면활성제를 줄이거나 제거).
	블로킹 버퍼가 항원 차단	일부 블로킹 용액은 특히 블로킹 단계가 >1시간인 경우 블랏을 가리고 항체에 대한 항원의 가용성을 감소시킬 수 있습니다. 1차 항체를 세척 버퍼에 희석합니다. 다른 블로킹 버퍼를 평가합니다.
	젤에 로드된 시료 양 부족	용해물이 너무 적으면 관심 표적의 양이 부족해집니다. 용해물 또는 시료의 연속 희석을 수행하여 로드할 최적의 단백질 양을 결정합니다.
	단백질 트랜스퍼 불량 또는 트랜스퍼 후 단백질 손실	트랜스퍼 조건을 검사하여 단백질 트랜스퍼를 확인합니다. 새로운 단백질을 프로빙할 때 다시 최적화가 필요할 수 있습니다.
비특이적 밴드	관심 표적의 낮은 항체 특이성	추가 1차 항체를 평가합니다. 관련 팁은 thermofisher.com/antibodyvalidation에서 확인하십시오.
	시료 무결성 불량	과열이나 프로테아제 활성으로 인한 시료 분해로 인해 표적 분해와 항체의 표적 인식 감소로 이어집니다.
	멀티플렉스 검출에서 항체 교차 반응	관련성이 먼 종에서 생성된 1차 항체를 선택합니다. 교차 흡수도가 높은 2차 항체를 사용합니다. 최적의 성능 범위 내에 머물기 위해 사용되는 2차 항체의 양을 줄입니다.
	멀티플렉스 분석 시 다른 채널의 형광 유출(bleed-through) 발생(예기치 않은 밴드 모양)	Fluorescence SpectraViewer와 같은 도구를 사용하여 형광단 스펙트럼을 시각화하고 특히 신호가 매우 강할 때 스펙트럼 상에서 가까운 콘주게이트를 피합니다. 이미저에서 형광 염료를 뚜렷하게 감지할 수 있는지 확인합니다. 기기의 자동 노출 기능을 사용하여 각 채널에 대한 최적의 노출 시간을 결정합니다.
백그라운드 문제(높음, 고르지 않음 또는 반점)	멤브레인 오염으로 인한 높은 백그라운드	깨끗한 접시나 트레이 및 깨끗한 핀셋을 사용하여 멤브레인을 조심스럽게 다루십시오. 애플리케이션에 가장 적합한 블로킹 버퍼를 결정하십시오. 1차 항체는 여러 가지 블로킹 버퍼에서 서로 다르게 반응합니다. 일반 동물 혈청 또는 우유와 같은 블로킹 버퍼를 사용하면 교차 반응이 나타날 수 있습니다.
	단백질 마커 또는 래더 오버로딩으로 인한 아티팩트	젤 위에 더 적은 양의 분자량 마커를 로드합니다.
	최적 상태가 아닌 세척액 또는 희석액	0.1-0.2% Tween 20 세제로 세척 버퍼를 사용합니다. 0.05% Tween 20 세제로 2차 항체 희석액을 준비합니다. 세척 단계의 횟수 또는 기간을 늘립니다.
	과다 2차 항체로 인한 높은 백그라운드	사용 중인 염료에 따라 공급업체의 권장 희석을 따르고 그에 맞게 조정하여 2차 항체 희석을 최적화합니다.
	멤브레인 건조로 인해 얼룩지거나 고르지 않은 백그라운드	모든 인큐베이션 단계에서 전체 블랏에 대한 충분한 범위를 포함하고 있는지 확인합니다. 모든 인큐베이션 단계에서 일관된 교반을 확인합니다.
	잘못된 멤브레인 선택	멤브레인 유형은 백그라운드에 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, PVDF 멤브레인은 자가형광을 발산하여 높은 백그라운드를 유발할 수 있으므로 저형광 PVDF 멤브레인을 사용하십시오.
	멤브레인에 묻은 먼지와 지문	깨끗한 핀셋을 사용하여 멤브레인을 다루고 멤브레인을 직접 만지지 않도록 합니다. 깨끗하지 않은 도구의 미립자 및 오염 물질이 형광을 발할 수 있습니다. 깨끗한 인큐베이션 트레이 또는 접시를 사용하십시오. 메탄올로 헹군 다음 물로 헹구면 이전 사용 시 남은 건조 염료를 용해하는 데 도움이 됩니다. 습식 트랜스퍼 방법을 사용할 경우 얼룩이 생길 수 있으므로 트랜스퍼 장치 및 먼지가 많은 소모품(예: 패드)을 청소하십시오. 이미징 작업을 위해 블랏을 넣기 전에 이미저 표면을 에탄올로 닦아 먼지, 보풀 및 잔여물을 제거합니다.

리소스

앱 노트 다운로드: 형광 웨스턴 블로팅 – 새로운 사용자를 위한 개요

앱 노트 다운로드: 형광 웨스턴 블로팅 – 멀티플렉스 분석을 위한 가이드

웨비나: 기존 및 최신 웨스턴 블로팅

형광 웨스턴 블로팅 이미징 및 단백질 정량

최근 이미징 소프트웨어 및 장비 감도의 발전으로 이제 형광 이미지 캡처 및 정량적 웨스턴 블로팅 분석이 더욱 쉬워졌습니다. 사용하려는 장비가 감지하려는 형광단의 수를 캡처할 수 있는지, 이미저에 형광단과 함께 사용할 올바른 필터가 있는지 여부를 확인하십시오.

iBright FL1500 이미징 시스템은 높은 감도와 효율성을 제공하며 다중 모드 이미지 캡처 기능을 갖춘 강력하고 편리한 시스템입니다(아래 이미지 2 참조). iBright FL1500은 4-plex 이미지를 쉽게 캡처할 수 있습니다. 대형 정전식 터치스크린 인터페이스와 지능적으로 설계된 소프트웨어가 특징입니다.

iBright FL1500 이미징 시스템에 대한 제품 세부 정보 보기
iBright FL1500 이미징 시스템 브로셔 다운로드

Four-channel imaging of a multiplexed fluorescent western blot

그림 2. 멀티플렉스 형광 웨스턴 블로팅의 4채널 이미징.

최대 4종의 서로 다른 단백질을 동일한 블랏에서 동시에 이미지화할 수 있습니다. HA-태그가 붙은 RB-1을 원스텝 인간 고수율 미니 IVT 키트(카탈로그 번호 88890) 및 적절한 즉시 발현 클론을 사용하여 HeLa 세포 추출물에서 발현시켰습니다. 생성된 반응 혼합물을 SDS-PAGE 환원을 위해 준비하고 연속 희석한 다음 Novex WedgeWell 4–20% Tris-glycine 젤(카탈로그 번호 XP04200PK2)에서 전기영동했습니다. 이 단백질은 Pierce Power Blotter(카탈로그 번호 22834)를 사용하여 PVDF 멤브레인으로 트랜스퍼되었으며, 이 멤브레인에 대한 블로킹 작업 후 chicken anti-calreticulin(카탈로그 번호 PA1-903), rabbit anti-HSP90(카탈로그 번호 PA3-013), mouse anti-p23(카탈로그 번호 MA3-414) 등의 1차 항체를 사용하여 프로빙했습니다. 이 멤브레인은 TBS-Tween 20에서 세척 후 goat anti-chicken Alexa Fluor 546(카탈로그 번호 A11040)(노란색으로 표시), goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 800(카탈로그 번호 A32735)(녹색으로 표시) 및 goat anti-mouse Alexa Fluor Plus 680(카탈로그 번호 A32729)(빨간색으로 표시) 등의 2차 항체로 프로빙했습니다. 멤브레인을 TBS-Tween 20에서 다시 세척하고 Alexa Fluor 488(카탈로그 번호. 26183-D488)(파란색으로 표시)에 직접 결합된 mouse anti-HA 1차 항체로 1시간 동안 프로빙했습니다. 멤브레인을 세척하고 iBright FL1000 이미징 시스템에서 이미지화했습니다.

정량

단백질 정규화는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 정량적 웨스턴 블로팅 결과를 얻기 위한 중요한 단계이며 하우스키핑 단백질 또는 총 단백질 정규화를 사용하여 수행할 수 있습니다. 이상적인 조건에서는 정규화가 필요하지 않지만 시료 로딩 및 트랜스퍼 효율 등의 요인으로 인해 웨스턴 블랏 정규화가 필수적입니다. 하우스키핑 단백질은 실험 조건에 의해 영향을 받을 수 있으므로 총 단백질 정규화가 보다 신뢰할 수 있는 방법입니다. 웨스턴 블로팅 데이터의 총 단백질 정규화에서 Invitrogen 무염색 단백질 라벨링 시약은 트랜스퍼 후 멤브레인에 적용되는 빠르고 사용하기 쉬운 시약이며 민감한 선형 검출 성능을 제공합니다.

iBright FL1500 이미징 시스템에는 무염색 단백질 라벨링 시약 및 기타 다양한 방법을 사용하여 정규화를 쉽게 수행할 수 있는 소프트웨어가 포함되어 있습니다.

무염색 단백질 라벨링 시약에 대해 자세히 알아보기

내부 로딩 제거 기능을 사용하여 정규화의 기본 원칙을 제공하고 웨스턴 블로팅을 정확하게 정규화하여 의미 있고 재현 가능한 데이터를 얻는 방법을 설명하는 이 기술 노트를 다운로드하십시오.

애플리케이션 노트: 웨스턴 블로팅에서의 정규화를 통한 상대 정량 달성

형광 웨스턴 블로팅 재프로빙

다른 항체로 블롯을 재프로빙하려면 Restore Fluorescent 웨스턴 블로팅 스트리핑 버퍼를 사용하십시오. Restore Fluorescent 웨스턴 블로팅 스트리핑 버퍼는 PVDF 멤브레인을 재사용 가능하게 하여 웨스턴 블로팅 최적화 프로세스를 간소화하고 다른 1차 항체로 동일한 블랏을 재프로빙하여 대체 표적을 검출할 수 있도록 합니다. Restore Fluorescent 웨스턴 블로팅 스트리핑 버퍼는 저형광 PVDF 멤브레인에만 사용됩니다.

Restore Fluorescent 웨스턴 블로팅 스트리핑 버퍼에 대한 제품 세부 정보 보기

전 과정에서 사용할 웨스턴 블로팅 솔루션이 필요하십니까?
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