抗体验证法，确保抗体的特异性与稳定性

Aled Edwards，结构精英组联盟的首席执行官（CEO）以及加拿大安大略省多伦多大学的教师。他是国际抗体验证工作组（IWGAV）的成员。

Anita Bandrowski，加州大学圣地亚哥分校研究与生物系统研究中心新科学信息框架的科学主管。她是SciCrunch的创始人兼首席执行官（CEO），也是国际抗体验证工作组（IWGAV）的成员。

Paul Wallace，纽约布法罗罗斯威尔公园癌症中心和研究所肿瘤学教授，流式细胞术和图像细胞分析仪器主管。他还是纽约州立大学布法罗分校的病理学副教授。

Matt Baker，Thermo Fisher Scientific抗体和免疫测定战略合作总监。

John Rogers，Thermo Fisher Analytics蛋白质和细胞分析业务中质谱试剂的高级研发经理

Christoph Hergersberg （论坛版主），Thermo Fisher Scientific蛋白质和细胞分析以及抗体和免疫测定研发部副总裁。

Edwards: 在过去30或40年中，抗体试剂的结果让人质疑。这是一个非常难以解决的问题，涉及从市场推动和科学激励机制进行分类。在5到6年前，当制药公司开始在学术文献中发表内部实验结果时，它确实走到了科技最前沿，他们发现大量早期项目无法重现。 

Bandrowski: 另一个增加可重复性困难的是研究人员发布结果的方式。研究人员获得了这些重大结果，但是其发表方式却不允许其他人在实际中重现这些结果。这是作为科学界，我们未做过最简单的事情之一。几年前，Vaseleski**论文中对此进行了论述，本质上表明超过一半的抗体都无法追溯至实际所使用的抗体。 

Edwards: 最近出现了一些颠覆性的新技术，这些新技术可实现对抗体的质量进行定量评定，如用于创建敲除细胞和质谱分析的CRISPR。这使得可针对抗体创建科学界可采用的行业标准。

**Vasilevsky NA, Brush MH, Paddock H, et al.On the reproducibility of science: unique identification of research resources in the biomedical literature.Abdullah J, ed. PeerJ.2013;1:e148. doi:10.7717/peerj.148.

Baker: 作为抗体的主要供应商和制造商，当我们与科学界的研究人员合作时，可重复性是Thermo Fisher Scientific关注的重点问题。客户希望其抗体能够发挥作用，因此我们使用新技术并侧重于确认抗体特异性、抗体稳定性。

我们已采用两步系统性方法来进行抗体验证，即验证功能应用和高级特异性确认。抗体特异性检测包括9种检测方法；免疫沉淀/质谱分析法、敲除、敲低、独立抗体确认、细胞处理、相对表达。中和、肽段芯片和正交方法。我们结合各种方法，包括每种抗体的检测数据，以确保透明度和可重复性。

Edwards: 对于质谱应用，当您从免疫沉淀物中获得蛋白质的肽类或从蛋白质中获得一系列肽时，是具有较高统计学意义的结果。您无法伪造此结果。因此，所有的方法都是绝对的。当您进行CRISPR敲除时，如果基因是正确的，那么蛋白质绝对不存在。 

Edwards: 简单的可重复性实验不是目标。目标是确保抗体结果可量化并且有标准的操作步骤。CRISPR敲除与质谱分析均是最佳方法，两者都具有定量结果。我认为您所有的检测方法都将是极好的“标志”，表明您在行业所建立的方法哪些是抗体的正确验证方法。 

Bandrowski: 我真正喜欢的另一件事是发布更多的数据。如果研究人员可通过查看大量的数据获得更满意的结果，那么就是有价值的。 

因此，您看到两者之间的比较是很多公司已经做的，而这正是我现在在做的事情并且出现了问题，因此能够看出，能够拥有完整数据，我认为是研究人员非常宝贵的资源。

Wallace: 如果我们正在谈论某个测试的试剂使用了CRISPR细胞系或描述的某种方法的方案，并且把具体的实验步骤加进来就更好了，因此如果我购买这种特定抗体或使用这种特定试剂，只要我遵循此程序，那么我将实际中可获得该结果。不同的实验室之间肯定存在很多差异，但是我们可以遵循使用特定试剂的方案，这样可使我轻松修改程序以观察是否可以改善此程序。 

最后，有许多抗体在蛋白质印迹中发挥作用，但在免疫组织化学方面完全失效。同样，有些抗体通过流式细胞术可发挥作用，但不能用于免疫组织化学中或者当你使用特定技术时不起作用。当您讨论您将如何进行抗体验证时，这不仅仅是一种方法或一种技术。确实有各种技术可证明抗体特异性、抗体稳定性，类似于您的两步抗体验证方法。

Wallace: 我将从特定细胞和我的问题开始，然后选择我需要解决特定问题的抗体。接着，我在制造商网站上搜索我的选项，以查看当我将培养板放在一起时，哪些流式克隆可供使用。如果我看到我的克隆经过验证，则将在流式细胞术中发挥作用，并且包含描述如何使用克隆的方案，那么肯定吸引我使用该特定试剂。

然后，我将确定荧光染料是什么，一种试剂与另一种试剂之间的串扰取决于其表达程度。第1步是滴定并验证培养板。当我将培养板放在一起时，将使用一些对照品，如FMO或荧光衰减试剂。这将验证培养板是否发挥作用，意味着我在群体中是否实现最佳分离。并且在此特定抗体发挥作用的方案和实例中，将加速该过程。

Bandrowski: 有许多方案需要改变，在行业发挥作用需要一定的时间。2016年，经费的评审标准发生变化，并且已经更新，趋于严谨。在接下来的五至十年，我们将看到经费转向生物试剂的鉴定，特别是抗体、细胞系等。这是一件非常重要的事情，因为涉及整个行业。

我希望一些其他的资助者也会效仿NIH，其中包括也在关注和转向可重复性的学术期刊。通过处理试剂的鉴定，我们可使论文与经费评审指南趋于一致。要使行业获得进展需要多年的历程，但是当今的每位研究人员都可贡献自己的力量。针对所有的抗体利用研究资源标识符并且尽可能共享数据。