单核细胞概述

1882年，Ilya Metchnjkoff首次描述了单核细胞，此后，证明了单核细胞对人健康和疾病至关重要[1]。单核细胞是白细胞的一个亚群，在维持机体稳态、病原体识别和清除以及炎症中发挥关键作用。小鼠的单核细胞约占其白细胞总数的4%，而人单核细胞占其白细胞总数的10%[2，3]。在骨髓祖细胞生成和发育后，单核细胞在脉管系统、骨髓和脾脏中循环；其在稳态下不增值。无论是在正常的发育过程中还是由于病原体攻击，一旦单核细胞迁移到外周组织，就会分化为树突状细胞或巨噬细胞。单核细胞的特征是可塑性和异质性，因为它可以快速调整其功能表型以响应变化的机体环境。

单核细胞是单核吞噬细胞系统（Mononuclear phagocyte system, MPS）的成员，MPS是对所有高吞噬性单核细胞及其前体的综合分类[3，4，5]。MPS包括除多形核粒细胞以外的所有髓系免疫细胞。在多色荧光活化细胞分选技术（FACS）出现之前，对MPS中细胞的来源和谱系知之甚少，FACS能够根据特定细胞标志物的表达来识别祖细胞和分化细胞群[4,5]。目前的单核细胞分化模型表明，循环单核细胞来源于具有髓系限制潜能的造血干细胞（HSC）源性祖细胞[4，5]。骨髓单核细胞分化期间被普遍认同的步骤包括髓系共同祖细胞（CMP）、粒细胞-巨噬细胞前体（GMP）、巨噬细胞和DC前体（MDP）（图1）[5，6]。

人单核细胞标志物

根据CD14, CD16 (Fcγ RIII), CD64 (Fcγ RI)和趋化因子受体CD192和CX3CR1的表达将人外周血单核细胞群定义为三个不同的亚群：经典型、中间型和非经典型（表1）。可以通过不同水平的HLA-DR和CD195以及受体TNFR1（CD120a）和TNFR2（CD120b）对这些亚群进一步进行分类。TNFR1在中间型单核细胞中表达最高，而TNFR2在非经典型单核细胞中表达最高[5，6，7，8]。

表 1.人单核细胞标志物。

小鼠单核细胞标志物

小鼠单核细胞也有三个不同的亚群（表2），由其细胞表面表达的Ly6C、CD11b和趋化因子受体CD192和CX3CR1来定义。此外，高水平的CD115表达能够区分外周血单核细胞和粒细胞以及淋巴细胞，淋巴细胞也表达CD11b（Mac-1）[5，6，8]。

表 2.小鼠单核细胞标志物。

趋化因子和单核细胞迁移

CCR2

CCL2（也称为MCP1）和CCL7（也称为MCP3）是与CCR2结合并且介导Ly6CBright单核细胞募集的CC趋化因子[9，10，12]。虽然CCR2的表达仅限于少数细胞类型，但大多数（如果并非全部）有核细胞在促炎细胞因子激活或一系列微生物分子刺激天然免疫受体时能够表达CCL2许多感染会诱导CCL2的表达，从而导致血清和炎症组织中CCL2的高度循环。CCL2二聚化并与组织糖胺聚糖结合，由此引导单核细胞向感染或炎症部位移动的梯度。支持这一模型的是，CCL2中的氨基酸突变抑制了单核细胞的募集，而此氨基酸突变可阻止自身二聚化并与糖胺聚糖的结合。

CCR1和CCR5

单核细胞也表达CCR1和CCR5，这些受体结合多种趋化因子，包括共享配体CCL3（也称为MIP1α）和CCL5[11，12]。体外迁移试验表明：（1）CCR1主要在剪切流存在时介导单核细胞阻滞；（2）CCR5有助于单核细胞”扩散“；（3）CCR1和CCR5都是通过内皮细胞向CCL5趋化。这些观察结果表明，这两种受体在单核细胞募集中具有特殊作用。表3总结了参与单核细胞募集的趋化因子。

表 3.参与单核细胞迁移的趋化因子受体。

黏附分子和单核细胞迁移

单核细胞募集遵循白细胞黏附和迁移的一般模式，包括滚动、黏附和迁移。白细胞（包括单核细胞）的迁移取决于整合素和其他黏附分子。小鼠中的LY6C^Hi单核细胞表达L-选择素、P-选择素糖蛋白配体1（PSGL1）、淋巴细胞功能相关抗原1（LFA1，也称为α_Lβ₂整合素）、巨噬细胞受体1（MAC1，也称为整合素α_Mβ₂）、血小板内皮细胞黏附分子（PECAM1）和迟现抗原4（VLA4，也称为整合素α₄β₁），所有这些均有助于白细胞黏附和迁移[13]。

在静息状态下，整合素LFA1介导LY6C^Low单核细胞沿着真皮血管内皮细胞游走。相反，LFA1缺失对LY6C^Hi单核细胞的早期募集不影响。这些结果表明，不同单核细胞亚群可能因组织类型和炎症状态不同而黏附机制不同[13]。表4总结了参与单核细胞募集的黏附分子。

表 4.黏附分子参与单核细胞迁移。

分离

可以从外周血单核细胞（PBMC）分离原代人单核细胞。首先通过密度梯度离心从人血或外周白细胞中分离PBMC。然后使用Invitrogen Dynabeads™ Untouched™人单核细胞试剂盒从PBMC中分离单核细胞，该试剂盒通过阴性分离从PBMC中分离较纯的、有活性的单核细胞。该试剂盒去除 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、树突状细胞、粒细胞和红细胞，而在样品中留存了保留阴性分选的人单核细胞。如果有细胞分选仪，则用CD14、CD64和CD192作为人单核细胞的特异性标志物。

细胞培养

原代人单核细胞可以在体外培养；然而需要注意的是，在血清或M-CSF存在的5天内，培养的单核细胞将开始分化为巨噬细胞。单核细胞以粘附和非粘附细胞的混合形式生长，粘附细胞的比例取决于培养基和刺激因子（如果添加）。如果使用自体血清，推荐使用RPMI 1640培养基，如补充5%胎牛血清的Gibco先进RPMI 1640培养基。
 

在稳态情况下，IL-34和CSF-1促进单核细胞分化和存活，而在炎症期则受GM-CSF的调节。趋化因子（CCL2、CCL3、CCL5）梯度促使单核细胞其从外周血迁移到组织中，在组织中根据不同的刺激分化为巨噬细胞、髓系树突状细胞或破骨细胞。单核细胞是促炎细胞因子的主要来源，如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8，其对病原体的天然免疫反应至关重要。多因子免疫试剂提供了一种有效的方法来检测血浆、血清或细胞培养物中单核细胞相关细胞因子的分泌。Invitrogen多因子检测试剂提供了一个方便的多因子线上选择工具，除了预混合的panel之外，还可以自定义个人多因子panel。

表5：参与单核细胞分化、募集和分泌的关键细胞因子。

多因子免疫检测试剂