Th17细胞概述

CD4⁺辅助性T淋巴细胞是细胞免疫的介质，在活化其他免疫细胞（如B细胞和细胞毒性T细胞）以及调节免疫反应中起着关键作用。CD4⁺辅助性T细胞进一步分化为以细胞因子分泌和效应功能为特征的亚群，这些亚群在外周由固有免疫细胞的诱导而实现分化[1]。首先描述的是两个亚群Th1和Th2[2]，这种二分法在发现新的CD4⁺辅助性T亚群（由于分泌IL-17A细胞因子而被称为Th17）之前已经存在了几十年[3、4]。Th17细胞在宿主防御细胞外病原体中发挥作用，特别是粘膜和上皮屏障处，但其异常活化与各种自身免疫性疾病的发病有关[5]。

与辅助性T细胞的其他亚群一样，外周的naive CD4 + 细胞接受T细胞受体（TCR）抗原刺激和活化抗原提呈细胞分泌的细胞因子，分化为Th17细胞[6]。虽然最初认为Th17细胞的分化是由IL-23诱导的，但后来证明Th17的发育与IL-23无关。然而，IL-23仍然被认为对Th17的维持和增殖具有重要作用，其受体（IL-23R）在活化的Th17细胞中表达上调[6]。。使Th17分化的关键细胞因子已被确定为与IL-6、IL-21和TGFβ[6、7]。IL-6和IL-21通过STAT3信号促进Th17转录调节因子的表达，从而使CD4 + T细胞定向分化为Th17谱系。STAT3信号通路的缺陷与IL-23R、关键Th17相关转录因子和效应细胞因子（如IL-17A和IL-17F）的表达减少有关[7]。

首先被确定为调控Th17分化的因子是RORγt，它是维甲酸相关孤儿核受体家族的成员[6]。 研究发现该转录因子可诱导IL-17A和IL-17F的表达，其缺失（但不是完全缺失）与Th17发育迟缓和功能减退有关[6、7]。后来的研究发现，相关的转录因子RORα也可以像RORγt一样，在应答STAT3的过程中促进Th17分化和细胞因子表达[8]。RORα和RORγt以协同方式促进Th17的分泌，两种因素共同缺失会导致Th17发育的完全抑制[8]。

在Th17发育中起作用的其他转录因子是IRF4、BATF和AHR。由于IRF4 缺失会导致Naive CD4⁺T细胞上调RORγt表达的能力降低，故IRF4被认为是RORγt的上游，但其在Th17生物学中的确切作用尚未完全查明[9]。调节性T细胞和Th17共同表达AHR，但Th17细胞表达更高。然而，AHR缺失不会影响Th17的分化，但效应细胞因子（特别是IL-22）的生成显著减少[10]。最后，尽管研究发现BATF并非Th17谱系独有，且BATF缺陷细胞仍能诱导RORα和RORγt，但BATF已被证明对Th17细胞的生成和相关细胞因子的表达是必要的[11]。

Th17细胞系具有高度的可塑性，且据观察，其在应答不断变化的环境因素时可以转分化为其他CD4⁺ 辅助性T亚型。调节T细胞是另一个依赖转化生长因子β进行分化的辅助性T细胞亚群；TGFβ浓度的增加倾向于使naive 细胞表达Foxp3，这种表达强烈抑制Th17的分化，转分化成调节性T细胞[12]。尽管如此，高水平的IL-6和由此活化的STAT3信号可以下调Foxp3的表达，有利于诱导TGFβ诱导的调节性T细胞表达Th17相关基因，特别是在存在IL-1的情况下[13]。虽然Th17细胞的转分化主要在Th1和调节T细胞中观察到，但也有证据表明Th2、T滤泡辅助细胞和TR1细胞也具有共同的功能[14]。观察发现，不同CD4⁺辅助性T细胞亚群的多个转录主要调节因子可以共同表达，进一步证实了这些谱系之间潜在的功能灵活性[15]。

CD4⁺辅助性T细胞的效应功能主要由分泌的细胞因子介导，每个亚群生成的特定细胞因子谱是是定义每个群体表型的主要特征之一[1]（图2）。Th17细胞是首个被确定为有别于持续了几十年的原始Th1/Th2模式的亚群，最初被定义的特征是基于IL-23刺激后IL-17A同型二聚体的表达[1、3]。 后来的观察发现，Th17细胞生成另一个同型二聚体IL-17家族成员——IL-17F，以及异质二聚体蛋白——IL-17AF，后者由IL-17A的一个亚基和IL-17F的一个亚基组成[16]。IL-17介导的反应在上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞中最具特征，这些细胞通过分泌TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8、CXCL1、CXCL8和G-CSF来应答IL-17R信号，从而促进中性粒细胞募集和炎症反应[17]。

细胞因子IL-22是IL-10家族成员之一，研究发现，它也是由Th17细胞分泌，尽管其诱导方式不同于IL-17A [18]。IL-22的表达更依赖于IL-23信号，而不是Th17分化相关的细胞因子TGFβ和IL-6，这表明它是由分化更充分的Th17细胞分泌的[18]。其受体是IL-22R1和IL-10R2的异二聚体复合物，主要在非造血细胞上表达，IL-22与其靶细胞的相互作用有助于宿主防御细胞外病原体，分泌β-防御素等抗菌肽，并促进伤口愈合[17]。

多效性细胞因子IL-21由包括Th17细胞在内的各种CD4⁺T细胞表达，经证明，其在这些细胞的发育和功能中起着关键作用。在Th17细胞中，它可以以自分泌方式发挥作用，类似于IL-6的方式通过STAT3信号诱导RORγt表达，从而进一步增加Th17的分泌[19]。除了促进Th17反应，IL-21还通过增强Th1细胞、CD8⁺细胞毒性T细胞和NK细胞的功能来促进细胞免疫[20]。B细胞的成熟、成体终末分化和功能也依赖于IL-21信号[21]。

虽然Th17细胞对维持粘膜免疫至关重要，但其失调与自身免疫性炎症的发病有关。正是它们促进这种炎症中的作用首次表明，与经典的Th1/Th2模型不同的第三个CD4⁺ T辅助细胞亚群的存在。 在最初的模型中，Th1细胞被认为是自身免疫的主要介质，但研究表明，缺乏其主要的Th1效应细胞因子IFNγ或其活化细胞因子IL-12，会加剧自身免疫性炎症，如自身免疫性脑脊髓炎（EAE）[22]。IL-23/IL-17轴（而不是IL-12/ IFNγ）被确定为介导这种炎症的主要途径[23]，后来的研究将Th17细胞描述为与该轴相关的新型CD4⁺ 辅助性T亚群[3、4]。Th17细胞已被证明在其他自身免疫性疾病的恶化中起作用，如类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化和炎症性肠病[5]。Th17细胞因子IL-17A和IL-17F促进靶组织生成促炎细胞因子，不仅能招募固有免疫细胞（如中嗜中性粒细胞）介导炎症，还以正反馈方式进一步促进Th17细胞的活化[5]。导致Th17细胞分化的精确环境因素决定了它们是向组织保护表型还是致病表型发展，因为研究表明，高水平的IL-6和IL-1β触发的分化有促炎性作用[13]。目前的研究继续探索Th17细胞及其细胞因子产物作为自身免疫的治疗靶点。

与健康组织相比，Th17细胞募集已经在多种恶性肿瘤中被观察到，尽管其募集的具体机制尚不清楚，并且其对整体病情预后的影响是多变的[14]。IL-17细胞因子与血管生长增多相关，因此在一些模型中增加了肿瘤生长和转移，观察还发现，Th17细胞转分化为更具免疫抑制表型的潜力在肿瘤免疫逃避中发挥了作用[14]。但是，经证明，Th17细胞募集CD8⁺细胞毒性T细胞和树突状细胞至肿瘤部位能促进肿瘤清除，这与它们在特定环境因素下转化为分泌IFNγ的Th1表型的能力类似[14]。整体而言，Th17细胞在癌症恶化中的作用似乎高度依赖于特定的肿瘤微环境。利用这种可塑性来控制它们提高抗肿瘤反应可能是开发癌症免疫疗法的一种有益策略。

以下描述了分离和研究人和小鼠Th17细胞的一些常用方法和工具，这些方法和工具可从赛默飞世尔科技获得。

从外周血、组织和肿瘤中分离细胞用流式细胞分析已被广泛用于研究Th17的生物学和功能。流式细胞术对Th17细胞的分型通常依赖于关键效应细胞因子（如IL-17A）或转录主要调节因子（如RORγt）的细胞内染色，以及CD4表面表标志物。尽管我们已经证实了一些候选标志物，但这些细胞固有的可塑性和不稳定性使得通过单一表面标志物识别Th17细胞变得困难。CCR6是趋化因子受体，在响应CCL20时驱动细胞迁移，其由Th17细胞表达，并参与炎症组织的募集[24]。 但是，CD4⁺CCR6⁺种群存在异质性，不仅包括Th17细胞，还包括相关的Th22和Th17.1亚群[24]。Th17和T调节谱系之间的可塑性使CCR6与CD4共同作为Th17细胞的主要表面标志物。文献也将人体中CD39与小鼠NK细胞标志物NK1.1人同源物CD161的共表达视为Th17谱系的潜在标志物[25]。表1列出流式细胞术使用的部分Th17细胞标志物。

在构建流式细胞分析panel时， “优化多色免疫荧光组合”（OMIP）是有用的参考，不仅提供已发表的标志物和荧光染料，还为分析提供设门策略建议。表2列出与Th17生物学相关的OMIP。

表 1.通过流式细胞仪分析Th17细胞表型的标志物。除非在“附加信息”栏中另有说明，则标志物人与小鼠相同。

表 2.与Th17细胞分型相关的“优化多色免疫荧光组合”（OMIP）。

免疫分析法是定量分析细胞培养基和生物液体中可溶性蛋白质水平的实用工具。它们通常用于研究细胞因子表达，其中包括由活化的Th17细胞分泌的效应细胞因子。Th17研究的免疫分析可以通过酶联免疫吸附试剂（ELISA）试剂盒检测溶液中单一分析物，也可以包括使用Luminex多因子检测平台分析同一样品中多种蛋白质。赛默飞世尔科技公司提供各种Invitrogen ProcartaPlex 多重检测板，通过Luminex技术检测Th17和其他辅助性T细胞细胞因子。与Th17生物学相关的组合见下表3。

表 3.用于研究Th17的Invitrogen ProcartaPlex Luminex Panels。

可以在体外利用重组细胞因子诱导出分化的功能性抗体，阻止促进Th1/Th2谱系发育的细胞因子传递信号，进而使CD4⁺ T细胞分化为Th17细胞。我们建议从流式细胞分选或磁珠富集试剂盒选定的CD4⁺淋巴细胞开始培养，然后参考详细的分化方案确定合适的时间点和试剂浓度，因为Th17标志物的表达可能取决于精准的培养条件。表4列出Th17细胞体外培养常用试剂。

表 4.Th17细胞体外培养试剂。关于推荐的浓度和时间点，请参考方案。