NK细胞（自然杀伤细胞）概述

自然杀伤（NK）细胞可选择性地溶解细胞，而无需事先活化。NK细胞属于天然淋巴细胞（ILC），天然淋巴细胞作为天然免疫系统的一部分，对于免疫监视和随后的宿主防御病毒感染和癌细胞至关重要。在人体中，自然杀伤（NK）细胞占循环淋巴细胞的8-20%；在实验室的近交系小鼠中，NK细胞占脾脏和骨髓淋巴细胞的2-5%[1，2]。与其他淋巴细胞（包括B细胞、T细胞和自然杀伤T（NKT）细胞）不同，NK细胞不表达克隆性B细胞受体或T细胞受体/ CD3ε复合体等抗原特异性受体。相反，自然杀伤（NK）细胞以抗原非依赖性方式（通常不会生成免疫记忆或长期保护性免疫）发挥作用。近期研究表明，NK细胞是癌症治疗的潜在治疗靶点[3]。

人NK细胞在骨髓（BM）和包括扁桃体、脾脏和淋巴结在内的次级淋巴组织（SLT）中发育及成熟[4]。细胞发育分为六个不同阶段（表1）。第1阶段只发生在骨髓，而第2-6阶段可发生在骨髓或次级淋巴组织中。造血干细胞发育成具有淋巴样或髓样偏向的多能祖细胞（MPP）。MPP细胞将生成一个淋巴样祖细胞，该细胞首先发育成NK前体细胞，然后发育成未成熟NK细胞，最后发育为成熟NK细胞。NK前体细胞（NKP）只能分化为成熟NK细胞，而不能分化为T细胞、B细胞、髓样细胞或红系细胞[1]。人NK细胞发育阶段主要基于CD34、CD117、CD56和CD94的表达水平。CD56表达增加是NK成熟的关键，紧随其后的是CD94/NKG2A表达。此外，白细胞介素2/15受体β（CD122）也是NK细胞发育后期的重要标志。

表 1.人NK细胞发育阶段表达的细胞标志物。

小鼠NK细胞在功能方面与人NK细胞相似，但其表达不同的发育标志物并且主要在专门的骨髓龛发育。[5]。NK细胞发育始于NK前体细胞（NKP）表达CD122，并经历六个特定阶段（表2）。相继获得NK细胞受体NKG2D/A/C、CD62L、Ly49和CD117（c-Kit）的信号后，小鼠NK细胞可发育成熟。CD51和CD49b的表达定义了小鼠NK细胞成熟的初始阶段[5，6]，而CD43（白细胞唾液酸蛋白）和CD11b （Mac1）的表达和Ly49受体信号的获得则定义了最终阶段。KLRG1的表达诱导小鼠NK细胞亚群迁移到次级淋巴组织。用CD27和CD11b对小鼠NK细胞进行了额外的功能分类[5，6]。

表 2.小鼠NK细胞发育阶段表达的细胞标志物。

大多数正常健康细胞表达主要组织相容性复合体（MHC）I类分子，该类分子将这些细胞标志物视为“自身”。当自然杀伤（NK）细胞抑制性受体识别同源MHC I类分子时，NK细胞的细胞毒性功能关闭从而阻止其杀死这些细胞。为获得识别“非自身”靶细胞（具有低MHC I表达）的能力，必须教育NK细胞使用同源抑制性受体检测宿主MHC I类分子，这一过程也被称为调节或许可。

NK细胞还可通过细胞因子的启动过程来适应环境，此类细胞因子包括IL-2、IL-15（由树突状细胞转化而来）、IL-18、IL-12和IFNα（图1）[7，8]。与邻近细胞相互作用后各种通路（抑制和活化）的整合控制着调节NK细胞活化的动态平衡，并决定了NK细胞是否活化以杀死靶细胞和生成细胞因子。天然免疫系统通常被认为缺乏免疫记忆能力；然而最新调查结果表明，一些NK细胞可以存活很长时间，并对异常细胞或病毒具有强大的回忆反应[5，6，7]。

NK细胞能够在无需预先激活的情况下进行免疫监视和宿主防御，因此细胞表面受体的表达至关重要。NK细胞可表达活化和抑制性受体，以及黏附受体。这些NK细胞受体充当感觉系统，并且此类受体的参与与随后的下游信号的平衡决定了细胞反应。

成熟的循环性NK细胞（人：CD56+，小鼠：CD49b+）组成性地表达多种活化受体（表3）。NK细胞在免疫细胞中的独特之处在于，所有成熟循环NK细胞都组成性地表达FCRγ、CD3ζ和DAP12 I型跨膜锚定蛋白，这些蛋白以二硫键结合型的同源二聚体或异源二聚体（在FCRγ和CD3ζ情况下）的形式存在。最重要的是，这些蛋白质在其胞浆区含有免疫受体酪氨酸基活化基序（ITAMS）——由序列（D/E）XXYXX（L/I）X6-8YXX（L/I）定义，其中X代表任意氨基酸，斜杠分开可能占据一个给定位置的替代氨基酸，X6-8表示两个YXX（L/I）元素之间的任意6-8个氨基酸。DAP12和FCRγ含有一个ITAM，CD3ζ每个链含有三个ITAM。在这些蛋白质的短胞内结构域中没有其他已知信号基序，而ITAM酪氨酸残基的突变破坏了其信号功能。 受体与配体结合后，再通过这些含含ITAM的分子促进下游信号传导。NK受体活化时，ITAM被Src激酶磷酸化，从而允许酪氨酸激酶Syk与Zap70结合并活化后者[9，10，11，12]。

激活NK受体的一个重要家族是自然细胞毒性受体（NCR），包括NKp30、NKp44和NKp46。受到刺激时，这些受体向NK细胞传递有效信号，最终溶解有害细胞并生成炎性细胞因子（如IFNγ）。NCR表达于成熟的循环NK细胞，在控制各种病毒感染和癌症方面起着关键作用。

第二个重要活化受体NKG2D的独特之处在于，在人NK细胞上表达时，其与胞内衔接蛋白DAP10相关联以启动不同的信号级联。DAP10含有一个YINM基序，能与PI3K结合并活化它。此外，DAP10能识别Vav1，而Vav1与Grb2相关。NKG2D从最早的NK细胞前体阶段开始表达，除了在溶细胞活性中起作用外，NKG2D还参与诱导其他激活性NK受体的上调[12]。

表 3.NK细胞活化受体。

NK细胞抑制性受体（表4）让NK细胞维持在非活性状态。一些NK抑制性受体对MHC I类分子具有特异性，而另一些则可以结合非MHC配体。其中一些NK抑制性受体（如杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）和白细胞免疫球蛋白样受体（LILR））属于免疫球蛋白超家族的单体I型糖蛋白，而Ly49和CD94-NKG2A受体等其他受体则是具有C型类凝集素支架结构的II型糖蛋白。所有抑制性受体在其胞浆区都含有一个共同的免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）[10，11，12]。

表 4.NK细胞抑制性受体。

大多数NK细胞驻留在脉管系统中，因此它们必须发生外渗并迁移到炎症、感染或肿瘤发生的部位。黏附受体（表5）对于这一过程至关重要，在NK细胞活化后，这些受体的表达增加[9，10，11]。

表 5.NK细胞黏附受体。

在免疫监视过程中，NK细胞不断与其他细胞接触。NK细可以诱导病毒感染的细胞和肿瘤细胞的细胞溶解活性（无需预先敏化或活化），因此杀伤与否取决于NK细胞表面活化受体和抑制性受体的信号平衡。如上文“NK细胞教育”章节所述，NK细胞与“自身”细胞相互作用，学习如何识别这些细胞，这种相互作用是由那些与健康细胞中MHC（HLA）I类分子特异性结合的NK受体的抑制信号介导的（图2）。当MHC I类分子与潜在的靶细胞结合但无任何活化信号的情况下，NK细胞将该细胞识别为“自身免疫”，并通过ITIM介导的信号减弱细胞溶解活性。当MHC I类分子在肿瘤或病毒感染细胞上出现缺失或下调时（“丧失自我”），抑制性受体信号丢失，导致NK细胞活化和随后的细胞溶解活性。当NK细胞活化受体从靶细胞表达的配体接收活化信号以对病毒感染或肿瘤发生作出反应时，“自我诱导”杀伤过程发生。这种活化信号将优先于抑制信号，导致NK细胞活化和随后的细胞溶解活性[9，10，11，12]。

NK细胞主要存在于外周循环，它们必须离开脉管系统才能遇到潜在的靶细胞。病毒感染细胞或肿瘤细胞释放的趋化因子会引发血管内皮炎症，内皮环境的改变可引起NK外渗和向趋化因子释放部位迁移。循环中的NK细胞停滞、跨内皮迁移（TEM）、趋化性、炎症部位趋触性、以及炎症部位黏附性均由β₁和β₃整合素介导。在炎症或肿瘤发生部位，NK细胞通过整合素（尤其是LFA-1）之间的相互作用与潜在靶细胞进行相互作用。

在与潜在靶细胞相互作用期间，NK细胞受体库通过抑制与活化信号的平衡来决定相互作用的结果。如果NK细胞的信号平衡有利于活化，则NK细胞继续进行信号转导和细胞结构的改变，这是NK细胞介导杀伤所必需的。当NK细胞与潜在靶细胞松散接触时，就会发生这种信号转导。做出杀伤决定时，NK细胞牢固地附着在靶细胞上。NK活化受体介导的信号会促进整合素LFA-1（引起整合素聚集和信号转导）由内向外进行信号转导。LFA-1介导的附着诱导肌动蛋白细胞骨架重组，在NK与靶细胞之间形成紧密的溶解性突触（图3）。随后MTOC极化到溶解性突触且微管蛋白出现重组和组装，使溶解颗粒分泌到溶解突触中（图4）。溶解颗粒聚合和极化是NK细胞在实现细胞毒性之前易受抑制信号影响的最后一步。在极化到靶细胞后以及脱粒前，含溶解颗粒的穿孔素和颗粒酶B位于溶解突触处，并与质膜融合。穿孔素被释放，并诱导靶细胞的膜翻转和快速凋亡（视频1） [13，14，15]。

颗粒酶（颗粒分泌酶）储存在自然杀伤（NK）细胞和细胞毒性淋巴细胞（CTL）溶酶体颗粒中，属于丝氨酸蛋白酶家族。颗粒酶对于诱导靶细胞凋亡至关重要，能分裂细胞内底物，触发许多凋亡通路以确保靶细胞死亡。此外，颗粒酶在抗病毒、肿瘤和胞内细菌免疫方面也发挥着重要作用。近期研究表明，颗粒酶可在细胞外发挥作用（导致组织和血管完整性破坏），这意味着颗粒酶参与了许多炎症和年龄相关疾病。该细胞家族正在成为参与免疫功能和监视的一个重要蛋白类群。

颗粒酶A

颗粒酶A是NK细胞毒性和CD8⁺细胞毒性T细胞颗粒中最丰富的丝氨酸蛋白酶。它不仅激活一种新的细胞程序性死亡通路-即始于线粒体并生成活性氧（ROS），最终活化单链DNA损伤，还靶向其他重要核蛋白进行降解，包括组蛋白、层连蛋白和几个关键的DNA损伤修复蛋白（如Ku70和PARP-1）。颗粒酶A也有促炎活性；其活化IL-1、TNF- α和IL-6，并可能具有其他尚未了解的作用。

颗粒酶B

颗粒酶B（GrB）存在于NK细胞和细胞毒性T细胞的颗粒中。基于在各种细胞毒性T细胞中的mRNA鉴定，颗粒酶B也被称为CGL1（组织蛋白酶G基质-1）和CTLA-1（细胞毒性T淋巴细胞相关丝氨酸酯酶1），但在非细胞毒性淋巴细胞中未被发现。颗粒酶B对于通过细胞凋亡（与细胞毒性T细胞相互作用诱导）快速诱导靶细胞死亡至关重要。颗粒酶B激活细胞内的半胱天冬酶内级联，并最终导致靶细胞杀伤。

颗粒酶K

像颗粒酶A一样，颗粒酶K是一种类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶，具有部分重叠但不相同的底物特异性。虽然颗粒酶K诱导ROS生成，但也可通过Bid-依赖性线粒体损伤诱导半胱天冬酶非依赖性细胞死亡。此外，数据还显示颗粒酶K能结合并剪切p53。据报道，这种剪切会引起肿瘤细胞介导杀伤。通过活化多种细胞死亡通路，杀伤细胞可以更好地保护细胞免受各种病原体和肿瘤侵害。颗粒酶K也显示出促炎潜能，目前已被证明，细胞外形式的颗粒酶K能够通过激活PAR-1诱导人肺成纤维细胞产生细胞因子。

人原代NK细胞可从外周血单核细胞（PBMC）中分离出来。从人血或外周血白细胞中分离PBMC，后续使用磁珠细胞分选（如Invitrogen Invitrogen Dynabeads Untouched人NK细胞试剂盒）NK细胞。流式细胞仪分选NK细胞也可以替代Invitrogen Dynabeads磁珠细胞分选方法。CD56和CD16是人NK细胞的特异性标志物，可以鉴别和分离不受其他淋巴细胞污染的NK细胞（图5）

NK细胞中的CD56表达水平决定表型特性[1]。CD56Low/CD16Hi（CD56偏低/CD16偏高）NK细胞构成大部分循环性NK细胞；CD56HiCD16−/Low NK细胞占较小部分。CD56Hi NK细胞在IL-12的刺激下增殖并生成细胞因子。CD56Low NK细胞更具细胞溶解能力，当其活化受体参与时，可生成大量细胞因子。CD56Low NK细胞与CD56Hi NK细胞有所不同。NK细胞在活化和抑制受体表达方面属于异质性群体。

培养的NK细胞与体内分离细胞表现不同，并且表达不同的NK细胞表面标志物。用IL-2培养的NK细胞将在CD57−CD56Low NK细胞亚群中诱导CD57表达。CD57+NK细胞高度成熟并具有多种特性，包括细胞毒性、对CD16刺激的敏感性、对细胞因子的较低反应性和增殖性。

小鼠NK细胞可通过Invitrogen Dynabeads磁珠细胞分选或流式细胞分选法从小鼠脾脏中分离出来[16]。单细胞悬液可根据CD49b+、NK1.1+和CD3-进行分类。所有小鼠NK细胞应保存在添加有IL-2的培养基中。

人原代人NK细胞最多可培养8周。NK细胞可在添加有10%人AB⁺血清、2 mM Gibco CTS GlutaMAX-I、1 mM丙酮酸钠、100 U/mL rIL-2和25U/ml rIL-15的Gibco Advanced RPMI 1640培养基中保存。在植物血球凝集素（100ng/mL）存在的情况下，通过与受照射K562细胞共同培养6-9天来实现NK细胞扩增。NK细胞应用于CD56⁺/ NKG2D^+高，并在含100ng/mL植物血球凝集素的RPMI完全培养基中与受照射K562共同培养。K562细胞应接受照射（6000拉德），以防止原代NK细胞增殖过程中的靶细胞增殖。

人NK细胞毒活性的定量测定可使用靶细胞-K562来确定（图6）。靶细胞和NK细胞应在经细胞培养处理的培养板上共培养（如Thermo Scientific Nunc 96孔微孔板、经细胞培养处理的平底光学聚合物微孔板），在4℃温度下于Gibco Hanks缓冲盐水溶液（HBSS）中用5µg/mL纤连蛋白包被过夜。然后在每个孔中添加密度为1x10⁵（K562）的靶细胞，并添加10ng/mL SDF-1α 后于37℃下粘附1小时。然后用HBSS冲洗孔板。将HBSS中密度为5x10⁵的NK细胞添加到每个孔中（一式三份），并在37℃下培养。细胞毒性可通过荧光成像用Invitrogen LIVE/DEAD Cell-Mediated Cytotoxicity Kit检测。细胞可使用EVOS Onstage培养室通过Invitrogen EVOS M7000成像系统进行成像，数据可使用Invitrogen Celleste图像分析软件进行分析。或者，可以使用高内涵分析平台对细胞进行成像和分析。

又或者采用流式细胞术，靶细胞可用Invitrogen CellTrace染料进行染色，然后添加Invitrogen SYTOX染料与效应性NK细胞一起培养。当NK细胞附着并杀死靶细胞时，细胞膜变为渗透式且SYTOX染料渗入，与核酸结合并发出荧光（可进行定量）。研究人员可使用Invitrogen Attune NxT流式细胞仪。

此外，也可使用以下流式实验方案来评估NK细胞：OMIP-029：人NK细胞表型和OMIP-027：人自然杀伤细胞的功能分析。

虽然单个细胞因子能发挥一些作用，但NK细胞的完全活化、增殖、存活和效应功能通常需要不同细胞因子的组合。正调节NK细胞功能的细胞因子包括IL-2、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21和IFG-g（主要由Th1细胞、巨噬细胞和树突状细胞生成）。相比之下，细胞因子IL-4、IL-5和IL-10（由Th2细胞分泌）或者IL-1β、IL-6、IL-10、IL-23、IL-35和TGFβ（由肿瘤细胞分泌）可抑制NK细胞功能。

表6：参与NK细胞活化、抑制和分泌的关键细胞因子。

NK细胞的发育至少有五个不同的阶段，在这些阶段中各种细胞因子受体的表面表达表明不同的细胞因子与从一个发育阶段过渡到下一个发育阶段有关此外，随着使用基于自然杀伤细胞的癌症免疫疗法的新机会增加，了解细胞因子和免疫检查点抑制剂在肿瘤微环境中的作用及其对NK细胞的影响将变得至关重要。活化NK细胞可分泌多种细胞因子和趋化因子，其中包括GM-CSF、IL-10、IL-5、IL-13、IFN-γ、RANTES、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β和IL-8（可使用免疫测定法测量）。此外，NK细胞上表达的免疫检查点标志物（如LAG-3、CD96、TIM-3、TGIT和PD-1）都能在血清或血浆中检测到。

多重免疫检测