调节性T细胞（Treg细胞）概述

调节性T细胞（Treg）对维持自身耐受性和免疫细胞稳态至关重要，这在免疫失调多内分泌病肠病x连锁综合征中发生的Treg细胞丢失或丧失功能导致的严重后果得到了证明。研究还发现Treg细胞（包括Foxp3⁺Treg细胞）在调节自身免疫性疾病的免疫反应中发挥了重要作用，包括1型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮（SLE）和重症肌无力。

表 1.Treg调节性T细胞的性质

据报道，Treg调节性T细胞有许多不同的免疫抑制机制。细胞接触依赖性抑制由TIGIT、CD39、CD73和CD152 （CTLA-4）介导，也可以由颗粒酶A和B对靶细胞的细胞溶解介导。虽然Treg细胞在活化时不分泌IL-2，但它们可以分泌免疫调节细胞因子，如IL-10、转化生长因子β和IL-35。据报道，在微环境和其他代谢紊乱中消耗IL-2是Treg抑制免疫反应的机制。

以Treg调节性T细胞为靶点的一些治疗药物，通过增强Treg调节性T细胞在自身免疫性疾病和移植物抗宿主病（GVHD）中的功能，或在某些癌症中阻断Treg的功能。例如，抗肿瘤坏死因子抗体可扩增类风湿性关节炎患者的Treg并稳定其功能，而低剂量IL-2可提高Foxp3⁺Treg细胞上CD25的表达，并扩增Treg细胞，在移植物抗宿主疾病、丙型肝炎病毒诱导的血管炎、1型糖尿病、斑秃和系统性红斑狼疮方面具有良好的效果。其他研究包括使用抗cd3抗体、抗cd25抗体、IL-2/抗IL-2复合物、抗il -6受体抗体和CTLA-4:Ig靶向自身免疫性疾病中的Treg针对治疗用途的Treg体外扩增和稳定的方法正在探索中。

Treg调节性T细胞最初被鉴定为CD4⁺ CD25⁺ T细胞群，具有抑制免疫反应的能力。磁性细胞分离方法利用Treg细胞高表达的CD25来富集人和小鼠的Foxp3⁺Treg细胞。将Foxp3确定为Treg的“主要调节因子”是定义Treg细胞为独特的T细胞谱系的关键一步。但是，缺乏抑制功能的T细胞也可能被诱导表达CD25和Foxp3。此外，Foxp3在细胞核表达，不适用为分离活的Treg调节性T细胞的标志物。

通过对Treg调节性T细胞表面抗原标志物的鉴定，可以对存活的Treg细胞进行鉴定和流式细胞仪分选，从而得到高度富集和带抑制功能的Treg。除CD4和CD25外，小鼠和人Treg细胞均可表达高水平的CD357 （GITR/AITR）和CD152 （CTLA-4），但CD127（IL-7Ra）的表达较低。添加CD45RO、CD39和CD73等标志物可以提高人Treg的富集，事实上已有多项研究表明，仅使用CD4、CD25和CD127分离人Treg显著富集活化的T细胞。CD45RA也被证明是区分人静息和效应Treg的标志物。类似地，在小鼠模型中，将CD39、CD45RB、CD101、FR4和CD73添加到CD4、CD25和CD127标记物panel中可以提高Treg调节性T细胞的富集。

Treg调节性T细胞以不同的状态（静息或活化）存在于特定的组织（肠道、脂肪、皮肤或肌肉）中，这可以根据其归巢和迁移标志物的表达来进一步区分。使用各种表面标记的一组抗体方案来鉴定和分离活的Treg细胞，可以富集Treg细胞亚群并对其下游抑制活性进行分析，以及离体扩增并转移回小鼠或人体内以调节免疫应答 。

Treg调节性T细胞能有效抑制免疫应答；但是，它们不是非常丰富的细胞种群。因为数量缺乏，所以体外扩增的方法很关键，包括扩增现有的Treg细胞或将Treg细胞从常规CD4⁺T细胞中分化出来，以便获得足够数量的细胞来研究其在体内和体外的功能。

在通过磁珠细胞分选或多参数流式细胞仪分选从人或小鼠中分离出活Treg细胞后，再通过刺激TCR和IL-2以及添加或不添加雷帕霉素在体外扩增获得该细胞群体。可使用培养板包被的抗CD3抗体、抗CD3抗体/CD28抗体偶联的磁珠或抗CD3抗体包被的抗原提呈细胞来实现对TCR的刺激。人Treg细胞的扩增通常需要共刺激信号，但体外扩增小鼠Treg细胞可能是不必要的。当使用磁珠分选试剂时，使用雷帕霉素可能是有利于Treg细胞的分离，因为众所周知，它可以抑制传统T细胞的扩增，从而促进Treg细胞优先扩增和存活。

对于小鼠，在IL-2和转化生长因子β存在的情况下，使用抗CD3抗体体外刺激naive CD4⁺ Foxp3-T细胞分化成Treg。抗CD28抗体的共刺激是必要的，因为其促进Foxp3表达的能力主要是通过增强内源性IL-2表达。有趣的是，虽然人的naive CD4⁺T细胞在类似的培养条件下可以被诱导表达Foxp3，但这些细胞没有抑制功能，并且在应对再刺激的反应中能分泌炎性细胞因子。一些研究表明，添加雷帕霉素或维甲酸有助于促进人细胞的抑制功能，但其他实验室尚未重现该结果。

可以在体外使用Treg调节性T细胞和效应T细胞的共培养系统研究Treg细胞的抑制功能。Treg调节性T细胞的来源可以是新鲜分离的、体外扩增的或iTreg。通常，在TCR刺激下以不同的比例的Treg调节性T细胞和效应T细胞培养达4天。最常见的评判标准是效应T细胞的增殖，要么通过稀释的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE），掺入的5-溴-2-脱氧尿苷（BrDU）或3H-胸苷。细胞因子生成、活化标志物的上调以及细胞计数也能进行评估。有趣的是，利用效应T细胞上CD25和CD134（OX-40）的表达进行为期两天的研究表明，CD25和CD134（OX-40）的表达与增殖相关，可以作为评判Treg调节性T细胞抑制功能的短期替代分子。

表 2.tTreg体外扩增试剂。

表 3.体外生成iTreg的试剂。

表 4.用于体外研究Treg抑制功能的试剂。

Treg调节性T细胞已通过多种方法被证明可以抑制T细胞的功能，机制包括接触依赖和细胞因子介导。其中包括TGF-b的分泌，它已被证明能强有力的抑制效应T细胞功能，IL-10作为T细胞抑制性细胞因子在特定环境中发挥作用，有研究表明IL-35对T细胞增殖有抑制作用。此外，研究表明趋化因子CCL3和CCL4可以作为诱导剂，能使细胞毒性T细胞靠近Treg细胞从而被抑制。实验还表明，与被刺激的Naive T细胞相比，Treg细胞表达高亲和力的IL-2受体的表面而竞争结合IL-2，间接影响T细胞增殖和功能。

表5：参与Treg分化和分泌的关键细胞因子。

Treg调节性T细胞也表达许多免疫关卡分子，包括细胞毒T淋巴细胞相关抗原4、PD‐1、Tim‐3、LAG‐3和TIGIT，它们能与抗原呈递细胞上表达的同源配体结合并传递正向或负向的免疫调节信号。这些免疫关卡分子中有几个以可溶形式存在，由其膜相关形式的蛋白水解切割而形成，或以可溶性形式表达。这些可溶形式可能具有活化或抑制抗肿瘤活性的功能，并可在血清或血浆中使用多重免疫分析试剂盒进行检测。