什么是模式识别受体(PRR)?

先天免疫系统是宿主抵御病原微生物的第一道防线,并依赖于种系编码受体,也称为模式识别受体(PRR)[1,2,3]。这些受体识别在微生物上表达的分子特征,称为病原相关分子模式(PAMPs),以及在受损宿主细胞上表达的分子基序,称为损伤相关分子模式(DAMPs)[1,2,3]。PRR与PAMP和DAMP的相互作用可导致促炎细胞因子和其他免疫调节分子的表达 (图 1)[1,2,3]。PRR主要由抗原呈递细胞(APC)表达,包括树突状细胞和巨噬细胞,但它们也被发现在其他免疫细胞和非免疫细胞上表达[2,4]。

在哺乳动物的几种不同类型PRR中,Toll样受体(TLR)得到了相当广泛的研究 [2,4,5]。其他模式识别受体包括RIG-I样受体(RLR)、Nod样受体(NLR)、AIM2样受体(ALR)和C型凝集素受体(CLR),以及cGas和其他细胞内DNA传感器(图 1) [6,7,8]。这一概述主要为PRR的TLR和RLR类别。
 

图 1.先天免疫细胞(如树突状细胞和巨噬细胞)识别出各种病原体[2, 3, 4]。这些免疫细胞表达模式识别受体(PRR),它们能够识别病原诱导的感染是通过某些蛋白质和其他分子基序(称为病原相关分子模式(PAMP)和损害相关分子模式(DAMP)),而PAMP和DAMP分别是在病原体和受损宿主细胞上发现的[2, 3]。模式识别受体包括Toll样受体(TLR)、核苷酸结合的寡聚结构域样受体(Nod样受体,简称NLR)和C型凝集素受体(CLR)[6, 8]。

Toll样受体(TLR)信号通路

Toll样受体在先天免疫系统中发挥重要作用,主要是识别病原相关分子模式 [1,2,4,5]。Toll样受体由树突状细胞(DC)、巨噬细胞和非免疫细胞(如纤维原细胞)表达。Toll样受体可以根据其细胞位置进行分类[2,3,4]。人的TLR家族由10个成员组成(TLR1-TLR10),而小鼠TLR家族有12个成员(TLR1-TLR9, TLR11-TLR13)。细胞表面TLR包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10,并都有胞外的结构域 [2,3,4]。胞内TLR包括TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13,它们位于内质网(ER)、内体和溶酶体中 [2,6,7]。细胞表面TLR识别细菌膜成分,如脂质、脂蛋白和蛋白质,而细胞内TLR主要识别核酸[8,9]。TLR识别的PAMP部分清单,见表 1

TLR被认为是I型跨膜蛋白,由一个N端配体识别域、一个单次跨膜域和一个C端信号域组成[10]。TLR的胞外域包含一段基序的串联拷贝,也称为富含亮氨酸重复结构(LRR),负责识别PAMP[10]。TLR的细胞内信号域与IL-1受体同源,被称为Toll/interukin-1受体(TIR)域[10]。这个信号域是发起下游信号通路所必需的10。TLR激活相关的两个主要信号通路包括MyD88依赖通路和TRIF依赖通路(图 2) [10]。
 

图 2.病原通过TLR在APC上激发的信号通路。像TLR1这样的细胞表面TLR具有胞外域,而像TLR3这样的细胞内TLR是位于胞内的 [2, 6, 10]。同源或异源二聚体的形成能够诱导下游信号通路,主要是MyD88依赖通路或者TRIF依赖通路[10]。TLR的下游通路引起促炎细胞因子的表达,包括白细胞介素-6(IL-6)、IL-8、IL-12和肿瘤坏死因子alpha(TNFα)[10]。

表 1.Toll样受体(TLR)识别的病原相关分子模式(PAMP) [8]。

TLR型(结构)衔接蛋白(结构)PAMP/激活蛋白物种
TLR1-TLR2 (LRR-TIR)MyD88(TIR-DD), TIRAP(TIR)Triacyl lipopeptidesBacteria
TLR2–TLR6(LRR–TIR)MyD88 TIRAPDiacyl lipopeptides
LTA
Zymosan
Mycoplasma
Bacteria
Fungus
TLR2(LRR–TIR)MyD88, TIRAPPGN Lipoarabinomannan
Porins
tGPI-mucin
HA protein
Bacteria
Mycobacteria
Bacteria (Neisseria)
Parasites (Trypanosoma)
Virus (measles virus)
TLR3(LRR–TIR)TRIF(TIR)dsRNAVirus
TLR4(LRR–TIR)MyD88, TIRAP, TRIF, TRAM (TIR)LPS
Envelope proteins
Bacteria
Virus (RSV, MMTV)
TLR5 (LRR–TIR)MyD88FlagellinBacteria
TLR7 (LRR–TIR)MyD88ssRNARNA virus
hTLR8 (LRR–TIR)MyD88ssRNARNA virus
TLR9 (LRR–TIR)MyD88CpG DNA
DNA
Malaria hemozoin
Bacteria
DNA virus
Parasites
mTLR11 (LRR–TIR)MyD88Not determined
Profilin-like molecule
Bacteria (uropathogenic bacteria)
Parasites (Toxoplasma gondii)

缩写:
dsRNA,双链核糖核酸;HA,血凝素;LPS,脂多糖;LRR,富亮氨酸重复;LTA,脂磷壁酸;MMTV,小鼠乳腺肿瘤病毒;MyD88,髓系分化原发反应88;PGN,肽聚糖;RSV,呼吸道合胞病毒;ssRNA,单链核糖核酸;tGPI-粘蛋白(糖基磷脂酰肌醇锚定的粘蛋白样糖蛋白);TIR,Toll/白细胞介素-1受体;TIRAP,含衔接蛋白的TIR域;TLR,Toll样受体;TRIF,含衔接子诱导干扰素-β的TIR域;TRAM,TRIF相关衔接分子。

 

RIG-I样受体(RLR)信号通路

虽然胞内检测TLR RNA有助于抗病毒免疫,但是RLR对于多数RNA病毒的免疫识别和应答至关重要 [11,12]。RLR主要识别单链RNA和双链RNA(ssRNA和dsRNA)。RLR家族的受体成员可以在所有细胞类型的细胞质中找到,并且由RIG-I(retinoic acid-inducible gene I)、MDA5(melanoma differentiation-assoicated gene 5)和LGP2(laboratory of genetics and physiology 2)组成 [13,14]。当出现病毒感染或存在细菌RNA时,RIG-I和MDA5能够诱导产生I型干扰素(IFN)和趋化因子。

RLR通常由两个N端半胱天冬酶募集域(CARD)、一个中心DEAD盒解旋酶/ATPase域和一个C端调节域组成 [12,13,14]。LGP2不含CARD域,因此其对下游抗病毒信号的影响可能是因为LGP2与dsRNA病毒配体的作用或与其他RLR(RIG-I和MDA5)的相互作用产生的。RLR位于细胞质中,能够识别dsRNA病毒的基因组RNA,也能识别ssRNA病毒复制中间体产生的dsRNA [15,16]。在IFN I型刺激或病毒感染的应答中,RLR的表达大幅增强 [13,14,15]。病毒RNA刺激RIG-I或MDA5表达相关的CARD域,这些域与K63多泛素链聚集成CARD四聚体,然后结合并激活衔接分子MAVS。MAVS募集TBK-1,TBK-1磷酸化IRF3,最终诱导I型干扰素基因的转录 [13,14,15]。
 

在Toll样受体(TLR)敲除小鼠中研究PRR通路

PRR通路对于建立抗微生物感染的有效防御是不可或缺的。一些研究调查了微生物病原体与其影响先天免疫系统之间的关系 [17,18]。

Qureshi 等人研究了小鼠对细菌脂多糖(LPS)的应答 [17,18]。他们的数据显示,对LPS应答的调节位于小鼠4号染色体上编码TLR4的 Lps 位点。这项研究确定TLR4是宿主对致病性LPS应答的关键调节分子 [17,18]。           

Oosting 等人研究了TLR1/TLR2异二聚体之间的关系和它们对包柔氏螺旋体属的应答[19]。TLR2的一个重要特征是它可以与TLR1和TRL6形成异二聚体 [19]。尽管TLR2被认为是包柔氏螺旋体属的主要受体,但有证据表明TLR1和TLR6发挥了作用[19]。TLR1和TLR6基因敲除小鼠被分别暴露于包柔氏螺旋体中。TLR1基因敲除小鼠表现出干扰素γ的表达增加,这与TLR6基因敲除小鼠相反,后者不能产生明显的干扰素γ应答。在两个敲除品系之间的促炎细胞因子中没有显著变化[19]。
 

Toll样受体(TLR)免疫学研究

TLR是病原体检测中至关重要的传感器,因此识别和表征免疫细胞表面的TLR表达对于研究病毒清除的细胞机制具有重要意义。流式细胞仪通常是分析免疫细胞TLR谱的首选方法。

一般来说,整个细胞群用活性染料染色,然后用TLR特异性荧光抗体进行免疫标记。为了对单细胞悬液中的所有活细胞进行染色,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗一次,并以1×106个/mL重悬于染色缓冲液中,如Invitrogen Bioscience流式染色缓冲液。接下来,向细胞悬液中加入1 µL活性染料,如 Invitrogen可固定活性染料。然后将细胞在室温或冰上避光培养30分钟,用1 mL PBS冲洗一次,并重悬在100 µL染色液中。

TLR1TLR2TLR4TLR5TLR6TLR10,这些TLR在细胞表面有胞外域,因此可直接用荧光抗体识别目标TLR(或光谱兼容的荧光抗体)对细胞染色(图 3,表2)。细胞在冰上培养30分钟,用染色缓冲液冲洗,然后重悬在300 µL染色液中。可以用流式细胞仪进来分析细胞,如Invitrogen Attune NxT 流式细胞仪。如果上样前需要固定细胞,可以使用固定缓冲液,如Invitrogen eBioscience 胞内固定缓冲液。在短暂培养后,将细胞冲洗并重悬于染色缓冲液中,再上样到流式细胞仪。

TLR3TLR7TLR8TLR9TLR11TLR12TLR13,这些细胞内TLR的抗体染色,细胞必须固定并破膜,使抗体与抗原接触。细胞已经免疫标记了细胞表面抗原,如上所述再进行固定,并使用破膜缓冲液进行破膜,如 Invitrogen eBioscience破膜缓冲液。完成固定和破膜后,细胞与识别相关TLR的荧光抗体试剂(或光谱相容的其他荧光抗体)一起培养 (表2)。细胞与抗体在冰上培养 30 分钟,用破膜缓冲液冲洗一次,用染色缓冲液冲洗一次,然后重悬于300 µL染色缓冲液中。重新悬浮后,可以通过流式细胞仪来分析细胞。

由于免疫细胞上高密度的Fc受体,背景荧光可能是个问题 [4]。我们建议使用未标记阻断抗体,如人类细胞的Invitrogen Fc 受体结合抑制剂多克隆抗体,或小鼠细胞的Invitrogen CD16/CD32 单克隆抗体 (clone 93)Invitrogen正常大鼠血清

在检测核内靶标中,例如NF-κB和其他转录因子的抗体标记(表2),我们建议使用Invitrogen eBioscience FoxP3/转录因子染色缓冲液来固定和破膜这些细胞(在上一步骤可能免疫标记了细胞表面抗原)。在固定和破膜后,细胞与一个或多个荧光抗体共同培养,这些荧光抗体能够识别这些转录因子。细胞在冰上培养30分钟,用FoxP3/转录因子染色缓冲液的破膜缓冲液冲洗一次、用染色缓冲液冲洗一次,然后重新悬浮于300 µL染色缓冲液中。重新悬浮后,可以通过流式细胞仪来分析细胞。
 

表 2.TLR标志物及其检测方法的部分列表[2, 4, 10]。

TLR标志物检测方法
胞外/胞膜标志物
TLR1WB, IHC, ICC, IF, Flow
TLR2WB, IHC, ICC, IF, Flow
TLR4WB, IHC, ICC, IF, Flow
TLR5WB, IHC, ICC, IF, Flow
TLR10WB, IHC, ICC, IF, Flow
细胞内标志物
TLR6WB, IHC, ICC, IF, Flow
TLR7WB, IHC, ICC, IF, Flow
TLR8WB, IHC, ICC, IF, Flow
TLR9WB, IHC, ICC, IF, Flow
TLR11WB, IHC, ICC, IF, Flow
TLR12WB, IHC, ICC, IF, Flow
TLR13WB, IHC, ICC, IF, Flow
NF-κBWB, IHC, ICC, IF, Flow, ChIP
细胞因子
IFNγWB, IHC, ICC, IF, ELISA
TNFαWB, IHC, ICC, IF, ELISA
IL-6WB, IHC, ICC, IF, ELISA
IL-8WB, IHC, ICC, IF, ELISA
IL-12WB, IHC, ICC, IF, ELISA
TLR 染色直方图

图 3.使用10 µL(0.5 µg)Invitrogen TLR7单克隆抗体,PE标记(Clone: 4G6,Cat. No. MA5-16249)(红色)和0.5 µg小鼠 IgG1同型对照(绿色)对1 x 106人类BDCM(具有 DC 形态的B细胞)中的TLR7进行流式胞内分析。

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