Th1细胞概述

顾名思义，辅助性T细胞（Th）为免疫系统的其他细胞提供辅助功能，特别是抗原呈递细胞（APCs），如巨噬细胞、树突状细胞和B细胞，并对这些细胞的活化和成熟起到重要的作用。CD4⁺ Th细胞有不同的亚群，包括Th1、Th2、Th17和调节性T细胞，每个亚群都由一组特定的细胞因子和转录因子活化，并以它们分泌的细胞因子和发挥的效应功能为特征。

Th1是什么细胞？Th1细胞因子来源于T细胞的α:β谱系，识别主要组织相容性复合体（MHC）I类或II类分子呈递的抗原。Th1细胞因子在识别和清除细胞内病原体如病毒和细菌，包括结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌和利什曼原虫方面起着重要作用。这些病原体通常存在于巨噬细胞等细胞内的吞噬小泡中，一般通过阻止溶酶体融合来逃避在细胞内被杀死。Th1细胞因子有助于活化巨噬细胞对抗这些病原体，并破坏它们的逃避策略。Th2细胞是CD4⁺ T细胞的另一个主要亚群，相比之下，该亚群帮助识别蠕虫、寄生虫等细胞外病原体，并激活B细胞介导的抗体反应。

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T细胞发育的第一阶段发生于胸腺（图1），在胸腺中Notch1信号转导以及TCF1、GATA3、Bcl11b等特异性转录因子的表达促进T细胞定型。α:β谱系所有T细胞亚群的发育都可以追溯到一个共同的祖细胞（Thp），该祖细胞经历一个双阴性（DN）（CD8^– CD4^–）阶段，接着是双阳性（DP）（CD8⁺ CD4⁺）阶段，然后胸腺细胞变成单阳性（SP）CD8⁺或CD4⁺。

MHC分子对SP细胞的成熟起着重要作用。CD4⁺ T细胞识别MHC II类分子提呈的抗原肽，这个过程由CD4共受体结合MHC II类链的恒定区所介导的。表达MHC I类或II类基因的转基因小鼠研究强调了MHC共受体相互作用在胸腺细胞发育中的重要性。MHC II类基因缺失导致仅CD8⁺细胞发育，而MHC I类基因缺失导致仅CD4⁺细胞发育，破坏T细胞群体中CD4/CD8的平衡。

DP细胞的固有寿命很短，仅3-4天，它只有过其TCR基因重组才能存活。这种拯救胸腺细胞免于凋亡及其随后成熟发展为SP细胞的过程称为阳性选择，在此过程中，识别自身MHC复合体的T细胞被选为进一步发育对象。当T细胞识别自身抗原-MHC复合物且具有高亲和力时，会发生相反的过程，即阴性选择：胸腺内的表达自身MHC复合体的细胞凋亡，从而防止有自身反应的T细胞活化[1]。

在胸腺发育阶段末期，未定向分化的Naive CD4⁺T （Th0）细胞前往二级淋巴器官，寻找由MHC II类分子呈递的抗原。识别抗原后，Naive T细胞经历克隆扩增并分化为不同的效应细胞亚型，而少数发育为记忆性T细胞。分化谱系主要由细胞因子、转录因子、共刺激信号和黏附分子影响。

在Th1分化中起关键作用的两种细胞因子是IFNγ和IL-12。APC分泌的IL-12能活化STAT4转录因子从而促进Th0细胞分化为Th1效应细胞因子。而STAT4能活化转录因子STAT1和Tbet促进IFNγ产生，这是Th1分化的另一个因素。Tbet被认为是Th1分化的主要调节因子，因为它诱导更多的IFNγ表达，形成增强Th1反应的正反馈环[1,2,3]。

表 1.促进Th1细胞发育的基因表达和细胞因子变化。

抗原识别还会生成记忆性Th1细胞，该细胞表达特征性标志物CD45RO。在随后的抗原刺激中，记忆细胞对于形成强大而快速的免疫反应非常重要。CD4⁺记忆细胞有三种类型：中央记忆性T细胞（TCM）、效应记忆性T细胞（TEM）和组织驻留记忆性T细胞（TRM）。TCM细胞具有高增殖潜能，而TEM细胞增殖潜能低但炎症效应功能强。CD4+记忆性T细胞的分化有不同的假说（见综述[4]）。其中一个假说猜想虽然记忆T细胞分化有一定的可塑性，但Th1效应细胞可能会生成TEM。记忆性T细胞分化亚群受细胞因子环境和转录因子活性主导。

共刺激（或共抑制）分子在APC上表达，并与T细胞上的分子相互作用，增强或减弱信号的生成。此外，它们还可以调节信号，使正在启动的转录程序发生变化。因此，这些分子在T细胞分化和不同谱系的命运中起着重要作用[2,3,5]。

表 2.对Th1细胞分化和功能具有重要作用的共刺激分子。

Th1细胞的主要效应功能在于细胞介导免疫和炎症，包括活化其他免疫细胞如巨噬细胞、B细胞和CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的细胞溶解和其他效应功能。Th1介导的其他免疫细胞活化的第一步是Th1细胞表面的CD40配体（CD40L）与巨噬细胞、B细胞和树突状细胞表面表达的CD40发生相互作用。效应Th1细胞还分泌大量的IFNγ，除了进一步扩增Th1细胞群，还通过诱导200多个靶基因活化巨噬细胞的溶解细胞活性。巨噬细胞中增加的细胞毒性活性是杀死细胞内病原体（如病毒，细胞内细菌和原生动物）的关键。Th1依赖性免疫反应的一个经典案例是分枝杆菌感染期间。分枝杆菌逃避巨噬细胞内的溶酶体融合；然而，MHC II类在受感染巨噬细胞表面上提呈出这些病原体的肽段，导致Th1反应活化，从而触发巨噬细胞的溶解细胞功能。

除了清除细胞内感染，Th1反应还在活化CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞以靶定和杀伤肿瘤方面起着至关重要的作用，此外还可增强CTL存活和记忆。CD40还促进B细胞中的类别转换，生成IgG2a抗体[5]。

表 3.Th1细胞分泌的细胞因子及其功能。

可以通过两种不同的方式来获取Th1细胞群体：

• 通过磁珠分离或流式细胞术（FACS）分选出部分T细胞（例如，Naive CD4⁺T细胞），然后使这些细胞进行体外活化并分化成特定的Th1亚群。
• 直接从外周血单核细胞中分离出Th1亚群。

T细胞的分离通常从Ficoll*密度梯度离心开始，分离出白膜层，里面包含T细胞和B细胞以及外周血单核细胞（PBMC）。可以通过阳性或阴性选择从外周血单核细胞（PBMC）分离出T细胞群体。在阳选中，使用T细胞特异性抗体富集T细胞群体。在阴选中，用其他群体（例如B细胞）的抗体把这些群体特异性去除，从而达到富集T细胞的目的。在阳性选择中，首先用针对T细胞谱系标志物（例如CD3或CD4）的生物素化抗体标志T细胞或T细胞亚群，然后加入Invitrogen Dynabeads链霉亲和素包被的磁珠。关于Ficoll密度梯度细胞分离的详细解释和描述，以及基于磁珠分选的T细胞阳选方案，可在T细胞刺激和增殖在线学习课程中找到。

或者，可用流式细胞术（FACS）从样品分离Naive CD4⁺T细胞。对于流式细胞分析，通常使用细胞表面蛋白和细胞内蛋白（例如细胞因子和转录因子）的荧光标志物组合。

一旦分离出CD4 ⁺群体，就可以通过使用抗CD3和抗CD28抗体交联共刺激TCR和CD28受体，实现T细胞活化和刺激。目前市面上有商业化的抗CD3和抗CD28抗体共价偶联磁珠。例如, 使用偶联CD28抗体的 Invitrogen Dynabeads刺激T细胞表面CD28共刺激受体来诱导T细胞活化和扩增。Th1的体外分化方案是使用IL-12和IFNγ处理Naive CD4⁺T细胞[5]。我们建议阅读Flaherty S，Reynolds JM（2015年），Mouse naive CD4⁺ T cell isolation and in vitro differentiation into T cell subsets作为分离Naive CD4 T细胞的设门和标志物的参考方案。

* GE Healthcare公司拥有Ficoll的注册商标

细胞因子谱分析通常用于对Th细胞亚型进行分类，也可以量化分泌的细胞因子。细胞因子酶联免疫吸附试剂（ELISA）可用于监测T细胞依赖性细胞因子的分泌，这些细胞因子是响应群体水平的活化和谱系特异性分化的。市面上已经有用于检测和定量数百种单个细胞因子的酶联免疫吸附试剂（ELISA）试剂盒。这些试剂盒通常是预包被抗体的96孔板，包含检测抗体以及标准品、缓冲液和辅助试剂。检测敏感度可达到皮克（pg）级水平。

虽然ELISA可以用于检测单个细胞因子的分泌，但Luminex多重分析技术的进步使得可以在单个样品或反应孔中高通量检测多种细胞因子。挑选抗体库里的抗体与不同强度荧光的微球结和，可以实现同时检测多种细胞因子。结合Luminex检测仪器，完成夹心检测定量。Invitrogen Th1/Th2细胞因子11-Plex Human ProcartaPlex Panel 使用Luminex平台检测11种细胞因子。

除了ELISA的方法之外，研究Th1和其他免疫群体的另一种常见且功能强大的工具是流式细胞术。尽管酶联免疫吸附试验（ELISA）可检测分泌的细胞因子的数量，但流式细胞术可用于检测表面或细胞内的标志物，以及细胞因子的表达来对细胞进行分析。此外，流式细胞术可用于计算其他群体与Th1群体的比例。发表在Cytometry Part A（威利的在线图书馆）杂志上的优化多色免疫荧光方案（OMIP）描述了通过流式细胞术以及特异性抗体和荧光染料的试剂盒对细胞类型进行广泛表征分析。OMIP-030（通过表面标志物对人T细胞亚群进行表征分析）和OMIP-008（检测人T细胞的Th1和Th2细胞因子多功能性）是研究Th1亚群非常有用的优化多色免疫荧光方案（OMIP）。基于流式细胞术，也可以使用 带有染色和刺激试剂的 eBioscience™ Essential 人 Th1/Th17 表型检测组合对Th1细胞进行鉴定和测试。