B 细胞概述

B细胞（也称B淋巴细胞）是一种在适应性免疫反应中起关键作用的白细胞[1]。B细胞可生成高亲和力抗体、生成免疫记忆、充当抗原呈递细胞，并分泌细胞因子（包括CCL22、CCL17、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-10、TGF-β1、IL-35。）。记忆B细胞和浆B细胞可生成诸如免疫球蛋白（Ig）IgM、IgG和IgE等抗体。本页介绍了B细胞在哪里发育成熟、B细胞的功能和B细胞研究方法等，包括细胞培养、免疫测定和细胞标记免疫表型分型。

B细胞在哪里发育成熟？

B细胞在特定器官和环境中发育是由节转录因子表达进行协调的[2, 3, 4, 5, 6, 7]。各细胞命运取决于特定B细胞的基因表达活化和沉默，可通过表面和细胞内标志物的表达来分析其发育状态。大多数B细胞都在骨髓（BM）中发育，随后在次级淋巴器官（SLO）中发育成熟并最终在血液中循环。

骨髓中的B细胞源自造血干细胞，并分化为共同淋巴样祖细胞或多能祖细胞（图1）。共同淋巴样祖细胞可生成T系细胞、自然杀伤细胞或B系细胞。B细胞谱系在骨髓特定的位置中经历阳性和阴性选择。

被选择的B细胞可迁移到SLO（包括脾脏或淋巴结）。从骨髓迁移至血液和脾脏的B细胞被称为过渡1（T1）B细胞。进入脾脏后，T1 B细胞可逐渐发育成熟并成为过渡2（T2）B细胞。在脾脏中，T2 B细胞将转变为滤泡性（FO）B细胞、边缘区（MZ）B细胞或B1细胞（人）。在小鼠中，B1转变发生在骨髓中。SLO是B细胞通过B细胞受体（BCR）与抗原结合并进行活化的地方。B细胞以依赖或独立于T细胞的方式活化（图2和图3）。一般而言，FO B细胞经历T细胞依赖性活化，而B1和MZ B细胞则倾向于T细胞非依赖性活化。

B细胞的T细胞非依赖性活化要求B细胞受体（BCR）聚集在B细胞表面（也称为交联），且具有Toll样受体（TLR）参与二级信号（图2）。当BCR在细菌或病毒表面识别到进化保守的重复表位时，就会发生BCR交联[1]。

B细胞的T细胞依赖性活化需要两种信号。第一种是BCR通过与外源靶点或游离可溶性抗原中的抗原表面分子结合而发生交联。第二种是通过T细胞中的CD40受体发出信号（图3）。

图 3.T细胞依赖性B细胞活化。这种类型的活化可生成记忆和血浆B细胞。Naive B细胞与可溶性或膜结合型抗原结合，并使抗原内化。B细胞在向MHCII上呈递这种抗原，并被辅助性T细胞（Th）识别。CD40受体与配体结合需要第二种信号。Th细胞分泌细胞因子，其可促进B细胞分化为能够生成IgG、 IgA、或 IgE的成熟B细胞[9]。
 

滤泡型（FO）B细胞

滤泡型（FO）B细胞源自淋巴滤泡生发中心，是人和小鼠的主要B细胞亚群[1]。此类细胞大多在血液中循环；然而，有些也存在于SLO中 [4]。小部分亚群通过非T细胞依赖性活化并生成于骨髓，而大多数FO B细胞在脾脏中以T细胞依赖性方式活化。它们的发育是由强大的BCR信号和阻断Notch2信号驱动的在感染期间，这些细胞能分泌大部分的高亲和力抗体。这些细胞与T滤泡辅助性细胞相互作用[9]。

边缘区（MZ）B细胞

边缘区（MZ）B细胞是抵御血源性病原体的第一道防线[5，6]。该细胞存在于脾脏和其他淋巴组织的边缘区，很容易接触到大量存在于循环血液的病原体。MZ B细胞是唯一一种依赖Notch2信号进行增殖的B细胞。在人体内，MZ B细胞存在于外循环以及身体其他部位，而对于小鼠，MZ B细胞只存在于脾脏中。

浆细胞

浆细胞针对生发中心的靶点生成高亲和力抗体，提供免疫记忆[9，10，11，12，13]。最初，SLO生发中心的B细胞因与辅助性T细胞（CD4）相互作用而被活化。B细胞在活化过程中经历体细胞高频突变和亲和力成熟，因此提高了B细胞对其自身特异性外源抗原的抗体（BCR）亲和力。活化B细胞可能出现BCR受体同种型转换（即IgG和IgE），并进一步分化成为生成抗体的浆细胞。相比浆母细胞，浆细胞能生成更多的抗体_。事实上，每个浆细胞在每秒钟能生成数百到数千个抗体。骨髓浆细胞是循环抗体的主要来源；然而，随着大量抗体生成，浆细胞会失去其作为抗原呈递细胞的能力并趋于死亡。一般而言，人们认为激活记忆B细胞能生成短寿命的浆细胞[14，15]。

记忆B细胞

与浆细胞相反，记忆B细胞的寿命很长，在重新遇到抗原之前其在一直处于休眠状态[1，2]。再次暴露抗原时，记忆B细胞可立即生成对抗其抗原的抗体。随着再次暴露于外源抗原，记忆B细胞立即重新活化并分化为能分泌抗体的浆细胞。IgG同型抗体由这些浆细胞中分泌，对特异性外源抗原具有高亲和力。这些IgG抗体能有效地快速中和病毒和细菌抗原，是包括免疫记忆（尤其是来自记忆B细胞和记忆T淋巴细胞）在内的二次免疫反应的一部分。

B细胞的典型特征在于B细胞受体（BCR），参与适应性免疫。BCR是一种锚定在B细胞膜上的抗体，可通过细胞内信号传导刺激B细胞的活化。这种跨膜受体包含两条重链和两条轻链（图4），由基因的可变区（V）、多变区（D）、结合区（J）和恒定区（C）重组而成[16]。每个成熟B细胞只生成一种具有单一特异性的BCR，因此只生成具有单一特异性的抗体。

图 4.B细胞受体Ig重链。BCR的可变区（V）、多变区（D）、结合区（J）和恒定区（C）重组形成Ig。互补决定区（CDR）是结合特定抗原的可变链的一部分。骨架区（FR）是BCR可变区（V）内的保守位点。
 

在没有刺激的情况下，B细胞不会进行增值。在培养条件下并给予外源信号，B细胞能够活化并且增值[19，20]。 其中BCR提供一个信号，并且该信号可用抗IgM或IgD抗体来模拟。第二个信号由共刺激分子（如CD40）和细胞因子信号（如IL-4）的提供。或者，细菌细胞壁的成分（例如脂多糖（LPS））以及具有高度重复分子的抗原也可直接发出B细胞活化信号 [21]。

用表达CD40L的基质饲养细胞和含特定细胞因子 cocktail的培养基，包括IL-2、IL-4、IL-21和BAFF[22]培养成熟、Naive 或记忆性B细胞，也可活化的B细胞。随后，活化B细胞可在与Th细胞的共培养中进一步分化。Th细胞结合并刺激共培养的B细胞。可以使用CFSE或BrdU检测活化B细胞的增殖情况。

Espstein-Barr病毒（EBV）感染的转化系细胞浆静息B细胞转化为持续增殖的淋巴母细胞样细胞系（LCL）。从癌症样本或感染Epstein-Barr病毒（EBV）的样本中可获得这些转化细胞系，其中包括Akata、Mutu I和Mutu III细胞。这些细胞系可在添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中生长[18]。

目前，已发表了多种优化多色免疫荧光组合（OMIP），可通过流式细胞术进行B细胞免疫表型分型（表1）。

表 1.已发表用于B细胞分型用的OMIP。

当用流式细胞术分析B细胞时，设门是非常直接的。大多数小鼠和人B细胞试剂盒包括细胞表面标志物CD19或CD20。B220可用作小鼠B细胞标志物，而非人pan-B细胞标志物。图5显示了使用CD19和IgG表达对B细胞进行分型的设门策略的一个示例。

图5.B细胞表型的设门策略示例。可分离SLO组织（脾脏、淋巴结、扁桃体）和血液，并在FACS缓冲液制备的单细胞悬液进行抗体染色。使用抗体cocktail进行染色后，可用流式细胞仪进行分析。细胞应按以下顺序设门：首先对活细胞进行设门。Dump通道或具有相同荧光色素的标记组合，标记其他细胞谱系，包括T细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，将确保更纯的细胞群。活亚群应当是CD19阳性和表达IgG的。FSC-A：线性标度的前向角散射区域，用于测量细胞大小；FSC-W： 线性标度的前向散射宽度，用于根据大小区分成对细胞；SSC-W：线性标度的侧向散射宽度，通过粒度区分成黏连细胞。
 

图6.通过流式细胞仪对经活化的成熟小鼠B细胞进行免疫分型。小鼠脾细胞未处理或用F(ab’)2山羊抗小鼠IgM (Mu链)抗体、或用过钒酸钠刺激。然后用抗-CD3和抗-B220对细胞进行表面染色，并用 p-BTK/ITK（Tyr551，Tyr511）单克隆抗体（M4G3LN）、PerCP-eFluor 710 进行细胞内染色。直方图显示CD3+-门T细胞（左）和B220+-门B细胞（右）上的磷酸化BTK/ITK水平。橙色线=未经刺激的脾细胞，紫色线=经抗小鼠IgM刺激的脾细胞，绿色线=经过钒酸钠刺激的脾细胞。

在B细胞的发育过程中，有多种细胞因子会影响B细胞的生长、存活和同种型转换。IFN-α和IFN-β参与骨髓B细胞的生成和选择，而IL-4和IL-6则影响B细胞优先分泌特定类别的抗体。IL-7是一种重要的细胞因子，主要作用于发育中的B细胞使其存活。

表3：参与B细胞分化、增殖、存活、募集、同种型转换和分泌的关键细胞因子

Naive B细胞不会分泌许多细胞因子，但活化B细胞可生成多种促炎和抗炎细胞因子，这些细胞因子从多方面影响免疫功能（包括效应性和记忆性CD4+T细胞反应的发展）。根据细胞因子的生成，B细胞可细分为生成“调节性”的抗炎细胞因子和生成“效应性”的促炎细胞因子B亚群。除细胞因子外，活化B细胞还会分泌参与Th2细胞募集的多种趋化因子（例如CCL22和CCL17）。Invitrogen Cytokine & Chemokine 34-pex human panel及36-plex mouse cytokine panel提供了一种经济有效多因子试剂盒来测量血浆、血清或细胞培养物中B细胞相关细胞因子的生成。除了检测细胞因子和趋化因子外，多重分型panels提供了一种方便的方法来确定单克隆抗体类别（例如IgG与IgM）和子类（例如IgG1与IgG2a），是杂交瘤发展关键且有益的工具。