哺乳动物细胞的冻存

将哺乳动物细胞冻存，可防止污染导致的细胞损失，尽量降低传代细胞系的基因变化，并避免有限细胞系发生老化和转化。在冻存前，应对细胞进行表征并检查是否受到污染。常用于冷冻细胞的培养基有多种。

对于含血清培养基，其成分可能有如下几种：

• 含 10% 甘油的完全培养基
• 含 10% DMSO（二甲基亚砜）的完全培养基
• 50% 细胞条件培养基与含 10% 甘油或 10% DMSO 的 50% 新鲜培养基

冻存培养基通常包含基础培养基、冷冻保护剂和蛋白质源。冷冻保护剂和蛋白质可帮助细胞抵抗冻融过程带来的压力。无血清培养基通常为低蛋白含量或不含蛋白，但是也可在以下配方的细胞冻存培养基中用作基础培养基：

对于无血清培养基，一些常见成分如下：

• 50% 细胞条件无血清培养基与含 7.5% DMSO 的 50% 新鲜无血清培养基
• 含 7.5% DMSO 和 10% 细胞培养级 BSA 的新鲜无血清培养基。

方案： 悬浮培养物

1. 确定待冻存的活细胞数量。细胞应处于对数生长期。以约 200-400 x g 的设置将细胞离心5分钟，得到细胞沉淀物。利用移液器尽可能移除上清液，而不扰动细胞。
2. 将细胞重悬于冻存培养基中，使用含血清培养基时浓度为 1 x 10⁷ 至 5 x 10⁷ 个细胞/mL，使用无血清培养基时浓度为 0.5 x 10⁷ 至 1 x 10⁷ 个细胞/mL。
3. 分装于冻存管中。将冻存管放置于湿冰上或 4°C 冷藏冰箱内，并在5分钟内开始冷冻程序。
4. 以 1°C/min 的速度缓慢冷冻细胞。这一步可使用可编程冷却器或将冻存管置于 -70°C 至 -90°C 冷冻冰箱的隔热箱中实现，然后转移至液氮中储存。

方案： 贴壁培养物

1. 利用解离剂将细胞从基质中脱附。尽量温和地进行脱附，以尽可能减少对细胞的损伤。
2. 将脱附的细胞重悬于完全生长培养基中，并对活细胞计数。
3. 以约 200 x g 的设置将细胞离心5分钟，得到细胞沉淀物。利用移液器尽可能移除上清液，而不扰动细胞。
4. 将细胞重悬于冻存培养基中，使得浓度为 5 x 10⁶ 至 1 x 10⁷ 个细胞/mL。
5. 分装于冻存管中。将冻存管放置于湿冰上或 4°C 冷藏冰箱内，并在5分钟内开始冷冻程序。
6. 应以 1°C/min 的速度缓慢冷冻细胞。这一步可使用可编程冷却器或将冻存管置于 -70°C 至 -90°C 冷冻冰箱的隔热箱中实现，然后转移至液氮中储存。

参考文献：

1. Freshney, R. (1987) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, p. 220, Alan R. Liss,Inc., New York.

要解冻冻存细胞，请参阅此方案