哺乳动物细胞传代介绍

以下步骤描述了贴壁培养哺乳动物细胞传代的一般流程。请注意昆虫细胞与哺乳动物细胞传代的一些关键步骤有所不同。有关详细信息,请参阅昆虫细胞传代培养注意事项

要传代您自己的细胞系,我们建议您严格按照实验中使用的每种产品随附的说明进行传代。偏离特定细胞类型所需的培养条件可能导致表达异常表型,甚至细胞培养完全失败。

贴壁培养哺乳动物细胞传代所需材料

  • 含有贴壁细胞的培养容器
  • 组织培养处理过的培养瓶、培养板或培养皿
  • 完全生长培养基,预热至 37°C
  • 15 mL 一次性无菌管
  • 含 5% CO2 湿润空气的 37°C 培养箱
  • 平衡盐溶液,如 Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (DPBS),不含钙、镁或酚红
  • 解离试剂,如胰蛋白酶或 Gibco TrypLE Express,不含酚红
  • 用于确定活细胞和总细胞计数的试剂和设备(例如 Countess II FL 自动细胞计数仪、台盼蓝和血细胞计数器或 Coulter Counter® (Beckman Coulter))

贴壁细胞传代步骤

视频:细胞传代方法

本视频解释了为什么、何时以及如何在贴壁培养物和悬浮培养物中传代贴壁细胞。这包括细胞解离、细胞计数、确定最佳接种密度和为传代细胞准备新的培养容器。

与细胞直接接触的所有溶液和设备都必须无菌。始终使用适当的无菌技术,并在生物安全柜中进行操作。

  1. 从培养容器中取出并丢弃用过的细胞培养基。
  2. 用不含钙和镁的平衡盐溶液清洗细胞(每 10 cm2 培养表面积约 2 mL)。向培养容器附着细胞层的对侧缓慢添加洗涤液,以避免干扰细胞层,并来回摇动数次培养容器。

注:洗涤步骤会去除任何抑制试剂解离作用的痕量血清、钙和镁。

  1. 从培养容器中取出并丢弃洗涤液
  2. 将预热的解离试剂(如胰蛋白酶或 TrypLE)添加到培养瓶一侧;使用足够的试剂覆盖细胞层(每 10 cm2 约 0.5 mL)。轻轻晃动容器,以完全覆盖细胞层。
  3. 室温孵育培养容器约2分钟。请注意,实际孵育时间因使用的细胞系而异。
  4. 在显微镜下观察细胞是否解离。如果细胞解离率低于 90%,则将孵育时间延长几分钟,每30秒检查一次分离情况。您也可以轻敲容器以加快细胞解离。
  5. 当≥ 90%的细胞已解离时,倾斜培养容器一小段时间,使细胞排出。加入相当于2倍体积(所用解离试剂体积的两倍)的预热完全生长培养基。通过几次移液,从细胞层表面分离培养基。
  6. 将细胞转移至 15 mL 锥形管中,然后以 200 × g 离心 5-10 分钟。请注意,离心速度和时间因细胞类型而异。
  7. 将细胞团块重悬于最小体积的预热完全生长培养基中,并取出样本进行计数。
  8. 利用血细胞计数器、细胞计数仪和台盼蓝拒染法或 Invitrogen Countess 自动细胞计数仪测定细胞总数和活细胞百分比。如有必要,向细胞中加入生长培养基,以达到所需的细胞浓度,并重新进行细胞计数。

注:我们建议使用 Countess 自动细胞计数仪测定细胞总数和活细胞百分比。Countess 自动细胞计数仪使用与您当前使用的血细胞计数器相同的样本量,对于典型的细胞计数,每份样本只需不到一分钟的时间,并且与各种真核细胞兼容。请参阅利用血细胞计数器进行细胞计数的方案。

  1. 将细胞悬浮液稀释至细胞系的推荐接种密度,并将适当体积的细胞移液至新的细胞培养容器中,然后将细胞放回培养箱。

注:如果使用培养瓶,在将其放回培养箱之前,如您使用的不是带透气盖的透气培养瓶,请先打开瓶盖,以便进行适当的气体交换。

昆虫贴壁细胞传代注意事项

尽管昆虫细胞传代培养的一般步骤与哺乳动物细胞相同,但这些培养体系的一些关键要求不尽相同。为获得最佳结果,请务必按照您实验中使用的每种贴壁细胞产品随附的说明进行操作。

  • 昆虫细胞在对数期传代。然而,如果您的昆虫细胞贴壁能力很强,您可在其达到汇合状态或刚刚脱离培养瓶底部时进行传代,此时细胞将更容易脱落。
  • 细胞密度低于汇合状态的 20% 时,生长会受到抑制。最健康的细胞是取自对数期培养物中的细胞。
  • 不建议在昆虫细胞培养中进行 CO2 交换。
  • 将昆虫细胞保存在 27°C 的非湿润环境中。可将细胞避光保存在室温条件下的试验台上或抽屉里。但是,还是推荐27°C的受控环境进行培养。
  • 使用专门为昆虫细胞生长配制的培养基。
  • 在无血清条件下,昆虫细胞非常紧密地附着在基质上,需要额外的力才能解离。要使这些细胞脱离,您可能需要借助手腕的快速运动来摇动培养瓶。为避免污染,在执行此步骤前请务必拧紧瓶盖。

注意:我们不建议剧烈摇动培养瓶,因为这可能会导致细胞损伤。