人诱导多能干细胞 (hiPSC) 的饲养层依赖性培养

诱导多能干细胞 (iPSC) 是利用各种方法从成纤维细胞等成体细胞类型中衍生而来的。iPSC 通常维持在一层失活的鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 饲养层细胞上。细胞可以在这些条件下维持数代，且不影响细胞的增殖或多能性和分化潜能。本实验方案描述了如何在饲养层细胞上培养成熟的 iPSC。

• Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (D-MEM)（货号 10569-010）
• 经 ESC 验证的胎牛血清 (FBS)（货号 10439-024）
• 含 GlutaMAX™-I 的 D-MEM/F-12 (1X)（货号 10565-018）
• KnockOut™ 血清替代物 (KSR)（货号 10828-028）
• MEM 非必需氨基酸溶液，10 mM（货号 11140-050）
• β-巯基乙醇，1000X（货号 21985-023）
• Gibco 小鼠胚胎成纤维细胞（经辐照）（货号 S1520-100）
• 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)（货号 PHG0264）
• GlutaMAX™-I (100X)（货号 35050-079）
• IV 型胶原酶（货号 17104-019）（用于酶传代）或 StemPro EZPassage™ 工具（货号 23181-010）（用于机械传代）
• 细胞刮刀（Falcon，货号 353085）
• 含钙、镁离子的 Dulbecco's PBS (DPBS)（货号 14040-133）
• 不含钙、镁离子的 Dulbecco's PBS (DPBS)（货号 14190-144）
• 附着因子（货号 S006100）
• 37°C 水浴
• 适当的组织培养板和用品

注：作为含 GlutaMAX™-I 的 D-MEM/F-12 (1X)、KSR 和 bFGF 的替代物，您可以使用 KnockOut™
ESC/iPSC 培养基试剂盒（货号 A1412901）。

1. 用附着因子 (AF) 溶液覆盖各新培养容器的整个表面，并将容器在 37°C 下孵育30分钟或在室温下孵育1小时。
2. 在层流培养罩中采用无菌操作，临用前通过抽吸完全去除培养容器中的 AF 溶液。包被容器可立即使用或在室温下储存不超过24小时。
   注：在加入细胞或培养基之前，无需洗涤培养表面。
3. 开始 hESC 培养或传代前 1-2 天，在附着因子包被培养容器中的 MEF 培养基上接种 30,000/cm² 有丝分裂失活
   MEF（见表1）
4. 将 MEF 培养皿放入 37°C、5% CO₂ 培养箱中。
   注：MEF 培养皿在接种后可使用最长 3–4 天。

表1.失活 MEF 的所需用量