使用 KnockOut™ 血清替代物 XenoFree 无饲养层完全培养基对人 iPS 细胞进行无饲养层培养和传代

2006年人们发现人和小鼠的成纤维细胞能够经过重编程而生成 iPS 细胞 (1-3)，其特性与胚胎干细胞十分相似，从而成为用于药物发现、细胞治疗和基础研究的多能细胞的宝贵新来源。

GIBCO® 培养基及试剂多年来一直处于多能干细胞研究的前沿。添加 KnockOut™ 血清替代物的 Knockout™ DMEM 是用于胚胎干细胞及 iPS 细胞培养的首选培养基 (3-9)。我们基于 KnockOut SR 配方推出了 KnockOut™ SR XenoFree，但该培养基在 cGMP 条件下使用人源或人重组蛋白生产而成，使多能干细胞研究可向临床应用过渡。通过添加 KnockOut™ SR 生长因子混合物，该金标准培养基系统现可用于无饲养层培养。

传统人 ES 和 iPS 细胞培养方法需要使用小鼠或人成纤维细胞饲养层或饲养层条件培养基。这些培养方法为劳动密集型方法，难以规模化，由于条件不明确，很难维持 hiPS 细胞不分化。Invitrogen 已开发出 Knockout™ SR 生长因子混合物，使您能够轻松地将 hiPS 细胞培养转换为无饲养层培养，同时仍然可以使用 Knockout™ SR XenoFree。

目的

以下实验方案提供了使用 KnockOut™ 血清替代物 XenoFree 无饲养层完全培养基 (KSR XenoFree FF) 使人诱导多能干细胞 (iPS) 适应无饲养层培养的说明。我们还提供了适应后持续维持的说明。

• 无菌组织培养通风橱
• 设置为 37°C 的培养箱
• 移液辅助器
• 设置为 37°C 的水浴
• 无菌血清移液器（5 mL、10 mL）
• 离心机
• 15 mL 离心管
• 60mm 经组织培养处理的培养皿

注：为保持无菌培养条件，本实验方案中的所有步骤均采用无菌实验室规范在层流罩下进行。

在开始之前，确保任何培养基均已平衡至 37°C，并进行适当的气体平衡。

制备 CELLstart™ 包被培养皿

1. 用含钙、镁离子的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (D-PBS) 按 1:50 的比例稀释 CELLstart™ (1 mL)。轻轻吸移溶液进行混匀。请勿涡旋。
   
   注：也可以按大于 1:50 的比例稀释 CELLstart™，但应针对单个细胞系进行优化
2. 用 CELLstart™ 溶液覆盖各培养皿的整个表面（35 mm 培养皿使用 1 mL，60 mm 培养皿使用 1.5 mL）。
3. 将培养皿于 37°C 下孵育 1–2 小时。
4. 使用前，将每个培养皿转移至层流罩中，并使其平衡至室温（约1小时）。
5. 注：您可以在 4°C 下储存 CELLstart™ 包被培养皿，以备次日使用。用 Parafilm 仔细包裹培养皿，防止干燥。
6. 临用前，从培养皿中吸出所有 CELLstart™ 溶液。去除 CELLstart™ 后，无需冲洗容器。

制备 KnockOut™ SR 无饲养层完全培养基

1. 要制备 1 mL 10 μg/mL 碱性 FGF 溶液，请在无菌条件下混合下列组分。分装溶液，在 -20°C 条件下可储存最长6个月。

注：BSA 可以用相同浓度的 HSA 或 Knockout™ SR 替代。

3. 要制备 100 mL KnockOut™ SR XenoFree 无饲养层 (KSR XenoFree FF) 完全培养基，请在无菌条件下混合下表中列出的组分。
   
   

   组分	储备液浓度	最终浓度	用量
   Knockout™ DMEM/F12（货号 12660-012）	-	1X	76.8 mL
   GlutaMAX™ -I（货号 35050-061）	200 mM	2 mM	1 mL
   KnockOut™ SR XenoFree（货号 A1099202）	-	20%	20 mL
   KnockOut™ SR-GFC（货号 A1448601）	50X	1X	2 mL
   bFGF（货号 PHG0024）	10 μg/mL	20 ng/mL	200 μL

   
   您可以将 KSR XenoFree FF 培养基在 2-8°C 下储存一周。
4. 在对完全培养基预先进行温度和气体平衡之前，先在无菌条件下加入所需用量的 2-巯基乙醇（55 mM 储备液浓度），使最终浓度为 0.1 mM。例如，要制备 100 mL KSR-FF 培养基，加入 182 μL 55 mM 2-巯基乙醇（1:550 稀释）；或者，可将 2-巯基乙醇加入 1X 完全培养基中，并在 2–8°C 下储存最长1周。

使人 iPSC 适应 KSR XenoFree FF 培养基

1. 在人包皮成纤维细胞或 MEF 饲养层细胞上培养人 iPSC，直至达到 70–80% 融合度。
2. 在 37°C 水浴中预热所需用量的 TrypLE™。有关所需用量的详细信息，请参见下表1。
3. 将所需用量的 KSR XenoFree FF 置于 37°C 水浴中预平衡 15分钟。有关所需用量的详细信息，请参见下表1。
4. 吸出培养皿中的培养基，加入适量的 TrypLE™。将培养皿在 37°C 下孵育 3-5 分钟。
5. 从每个培养容器中吸出 TrypLE™，并用 D-PBS 轻轻洗掉 MEF 饲养层细胞（2到3次）。
6. 向每个培养容器中添加适量的 KSR XenoFree FF 培养基。使用细胞刮刀或 5 mL 移液器从培养容器表面轻轻刮下细胞。
   
   注：难以适应的 iPS 细胞系的替代适应方案见附录。
7. 将每个培养皿中的细胞悬液收集到单独的 15 mL 锥形管中。使用适量 KSR XenoFree FF 完全培养基冲洗每个培养容器，并将 D-PBS 冲洗培养基加入含有细胞悬液的 15 mL 锥形管中。小心不要将细胞团块破碎成单细胞
8. 以 200 × g 离心 15 mL 锥形管5分钟，使 iPSC 沉淀。
9. 从 iPSC 沉淀上吸去上清液。根据分传比例，用适量 KSR XenoFree FF 培养基重悬沉淀（表1）。请勿将细胞团块破碎成较小的团块，因为较小的团块不能很好地附着在表面。
   
   注：我们建议在将 iPSC 直接从基于 iPSC 饲养层的培养基传代至 KSR XenoFree FF 培养基后，前3次传代的分传比例为 1:2。通常情况下，适当的分传比例在 1:3 至 1:5 之间，但是 1:2 传代可确保适应无饲养层培养物时获得所需的更高细胞密度。
10. 从预包被的培养容器中吸出 CELLstart™ 溶液，并向每个培养容器中缓慢加入适量的细胞悬液。
11. 将培养皿前后左右移动数次，使细胞分散在培养皿表面。将培养皿轻轻放置于 37°C、含 4-6% CO₂ 潮湿空气的培养箱中。每天使用 KSR XenoFree FF 更换用过的培养基。

使用 KSR XenoFree FF 对人 iPS 细胞进行传代

1. 在显微镜下观察在 KSR XenoFree FF 完全培养基中生长的人 iPSC，确认细胞达 70-80% 融合度，可进行传代培养。见图1。
   
   注：如果集落过密或过大，则分化增强。
2. 在传代培养物之前，切下并去除任何分化的 iPSC 集落。
3. 在 37°C 水浴中预热所需用量的 TrypLE™。有关所需用量的详细信息，请参见下表1。
4. 将所需用量的 KSR XenoFree FF 置于 37°C 水浴中预平衡 15分钟。有关所需用量的详细信息，请参见下表1。
5. 用移液器从培养容器中吸出用过的培养基，并用 D-PBS 冲洗细胞两次。
6. 向培养容器中轻轻加入预热的 TrypLE™（例如，每 60 mm 培养皿加入 1 mL TrypLE™ 溶液）。涡旋培养容器以包被整个细胞表面。
7. 将培养容器在 37°C 下孵育3分钟。
8. 从培养箱中取出容器，吸出 TrypLE™，并用 D-PBS 轻轻洗涤细胞。
9. 使用细胞刮刀将细胞从培养皿表面轻轻刮下，并将细胞转移至 15 mL 无菌离心管中。
10. 用 KSR XenoFree FF 冲洗培养皿两次，轻轻“冲下”任何未脱附的细胞。将冲洗培养基与细胞合并至 15 mL 试管中。
11. 在室温下以 200 × g 离心试管5分钟，使细胞沉淀。
12. 在不扰动细胞沉淀的情况下小心吸出上清液并弃去。
13. 轻弹试管，使细胞沉淀完全脱离试管底部。
14. 使用 5 mL 血清移液器将细胞轻轻重悬于预平衡的 KSR XenoFree FF 中。切勿捣碎。注：本步骤的关键是轻轻重悬细胞，切勿用力，以免损伤细胞。
15. 按所需分传比例将细胞转移至新的 60 mm CELLstart™ 包被培养皿中，然后将培养皿前后左右移动数次，使细胞分散在培养皿表面。
16. 将培养皿置于 37°C、含 4-6% CO₂ 潮湿空气的培养箱中。

第二天，用 KSR XenoFree FF 轻轻替换用过的培养基，以去除细胞碎片。此后每天更换用过的培养基。每天观察 iPS 细胞并在需要时进行传代（大约每 4–5 天一次）。建议在细胞达 70-80% 融合度时进行传代。对于 iPS 细胞冻存和解冻，请参见我们题为“在含或不含饲养层的 KnockOut™ 血清替代物 XenoFree 完全培养基中冻存和复苏人 iPSC”的实验方案。

图1：下面的相差图像显示了在使用 KnockOut™ 血清替代物 XenoFree 无饲养层完全培养基的 CELLstart™ 包被培养皿上培养的 iPSC。iPSC 的形态类似于 hESC，其特征为细胞核大而细胞质少。（40倍放大）



表1 - 推荐用量

• Takahashi, K. et al.(2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell 126:663–676.
• Takahashi, K. et al.(2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell 131:861–872.
• Yu, J. et al.(2007) Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.Science 318 :1917–1920.
• Maherali, N. et al.(2008) Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.Cell Stem Cell 3:595–605.
• Li, W. et al.(2009) Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.Cell Stem Cell 4:16–19.
• Liao, J. et al.(2009) Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.Cell Stem Cell 4:11–15.
• Dimos, J.T. et al.(2008) Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.Science 321:1218–1221.
• Aasen, T. et al.(2008) Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.Nat Biotechnli 26:1276–1284.
• Park, I.H. et al.(2008) Generation of human-induced pluripotent stem cells.Nat Protoc 3:1180–1186.

Knockout DMEM/F12 和 GlutaMAX™ 可替换为以下替代物：

1. 含 GlutaMAX™-I 的 DMEM/F-12（货号 10565-018）

要使用含 GlutaMAX™-I 的 DMEM/F-12（货号 10565-018）制备 100 mL KnockOut™ SR XenoFree 无饲养层 (KSR XenoFree FF) 完全培养基，请在无菌条件下混合下表中列出的组分。

2. Knockout™ DMEM（货号 10829-018）和 GlutaMAX™-I（货号 35050-061）

要使用 Knockout DMEM（货号 10829-018）制备 100 mL KnockOut™ SR XenoFree 无饲养层 (KSR XenoFree FF) 完全培养基，请在无菌条件下混合下表中列出的组分。

替代物 bFGF 包装规格

1. 如上所述使用 CELLstart™ 包被培养板
2. 第1代：75% MEF 条件培养基 + 25% KSR XenoFree FF
3. 第2代：50% MEF 条件培养基 + 50% KSR XenoFree FF
4. 第3代：25% MEF 条件培养基 + 75% KSR XenoFree FF
5. 第4代及之后：100% KSR XenoFree FF
   
   注：如果 iPS 细胞系存在严重问题，则可以采取进一步的谨慎措施，即在开始下一个适应水平时，在各先前传代培养基中维持培养物。例如，在对 25/75 MEF 条件培养基/KSR XenoFree FF 培养物（如上所述）进行传代时，可在 100% KSR XenoFree FF 和 25/75 培养基中同时传代 iPS 细胞。如果 100% 培养效果不佳，则可使用备份的 25/75 培养恢复适应。

直接和部分顺序策略：

1. 如上所述使用 CELLstart™ 包被培养板
2. 将细胞分传到三块培养板（培养板1、2和3）中
3. 第1次传代时，将培养板1直接接种至 KSR XenoFree FF 中，将培养板2和3接种至 MEF 条件培养基/KSR XenoFree FF 培养物中。
4. 第二天，当天用 KSR XenoFree FF 为培养板2换液，此后每天换液。
5. 第2次传代时，对于培养板3，尝试以 1:2 的分传比例将这些细胞直接铺于 KSR XenoFree FF 中（如上）。