在无血清和无异种成分条件下培养人间充质干细胞 (MSC)

无血清、无异种成分培养基

开发 StemPro MSC SFM XenoFree（Chase 等人，2013）的目的是在完全无血清且无异种成分的条件下培养和扩增人间充质干细胞 (MSC) 和脂肪源性干细胞 (ADSC)。使用 StemPro MSC SFM XenoFree，人 MSC 或 ADSC 可以多次传代扩增并保持其多向分化潜能表型（即，分化为成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞谱系的能力）（请参见附录 A）。

由于人 MSC 在初生组织中的频率较低，因此这种干细胞群的扩增非常关键，有助于进行基础生物学研究和临床研究。此外，人 MSC 增殖次数有限，此后会表现出增殖和分化潜能降低。在 StemPro MSC SFM XenoFree 中扩增人 MSC 和脂肪源性干细胞 (ADSC)（Lindroos 等人，2009；Sugii 等人，2010）在形态学和生长特性方面与在经典培养基（DMEM + 10% 经 MSC 验证的 FBS）中相当（图1）。

图1.人 MSC 在无异种成分条件下的扩增。在 DMEM（低糖）+ 10% 经 MSC 验证的 FBS 或在 StemPro MSC SFM XenoFree + CTS™ CELLstart™ 底物包被培养板中扩增的人骨髓源性 MSC 显示出相似的扩增速率。(A) 扩增的（第3代）人 MSC 的形态（10x 物镜）。(B) 人 MSC 的净扩增。起始人 MSC = 第5代，4供体池。传代频率 = 每 4–6 天。接种密度 = 5–7 x 10³ 个细胞/cm²。收获酶 = TrypLE™ Express。计数方法 = Countess 自动细胞计数仪。

当与 CTS CELLstart 底物结合使用时，StemPro MSC SFM XenoFree 提供了一个完全无异种成分的系统；因此细胞在生理环境中生长，从而可获得具有临床意义的结果。

CTS™ StemPro MSC SFM 是一种专门配制用于人间充质干细胞 (MSC) 或脂肪源性干细胞 (ADSC) 生长和扩增的无血清培养基。使用 CTS™ StemPro MSC SFM，人 MSC 或 ADSC 可以多次传代扩增并保持其三系中胚层分化潜能（即，分化为成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞谱系的能力）（请参见附录 A）。CTS™ StemPro MSC SFM 适用于人离体组织和细胞培养处理应用。

与经典培养基（DMEM [低糖] + 10% FBS）相比，StemPro MSC SFM（Chase 等人，2010；Agata 等人，2009；Ng 等人，2008）可在高细胞密度下提供更出色的人 MSC 扩增效率（图2），且所需培养基、表面积和时间更少。在经典培养基中培养的人 MSC 具有扁平的细胞形态，并在 1.0–3.0 x 10⁴ 个细胞/cm² 时达到融合，而在 StemPro MSC SFM 中培养的人 MSC 具有更小的梭形形态，密度可达 >1.0 x 10⁵ 个细胞/cm²（见附录 A）。

表1.根据您的研究需要选择合适的 MSC 培养系统

MSC 培养系统	减血清*	无血清*	无异种成分、无血清*
支持从初生组织中衍生 MSC			**
细胞或组织来源	骨髓、脂肪、脐带血、胎盘	骨髓、脂肪、脐带血、胎盘	骨髓、脂肪、脐带血、胎盘
物种	人、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、马	人	人
维持 MSC 表型
支持三系分化
促进软骨生成
按照 cGMP 生产标准进行生产
提供批间一致性
无动物组分
基础培养基	MesenPRO RS 基础培养基	CTS StemPro MSC SFM 基础培养基	StemPro MSC SFM 基础培养基
添加剂	MesenPRO RS 生长添加剂 CTS GlutaMAX-I 添加剂 [2 mM L-谷氨酰胺]	CTS StemPro MSC SFM 添加剂 CTS GlutaMAX-I 添加剂 [2 mM L-谷氨酰胺]	StemPro MSC SFM XenoFree 添加剂 CTS GlutaMAX-I 添加剂 [2 mM L-谷氨酰胺]
细胞外基质	不需要	CTS CELLstart 底物、纤连蛋白	CTS CELLstart 底物、纤连蛋白
支持在高细胞密度下生长
接种密度	3–5 x 103 个细胞/cm2	≥ 5 x 103 个细胞/cm2	≥ 1 x 104 个细胞/cm2
补料时间表	3–4 天	2-3 天	2-3 天
传代时间表	4-7 天	3-4 天	3-4 天
传代	TrypLE、胰蛋白酶、StemPro Accutase	TrypLE、胰蛋白酶、StemPro Accutase	TrypLE
冻存培养基	MesenPRO RS 培养基 + 10% DMSO	CTS StemPro MSC 无血清培养基 + 10% DMSO 或 CTS Synth-a-Freeze 培养基	StemPro MSC SFM XenoFree 培养基 + 10% DMSO 或 CTS Synth-a-Freeze 培养基

对于培养和骨髓分离

• 人 MSC (GMP)（StemPro BM 间充质干细胞）（货号 A15652）或人 ADSC（StemPro 人脂肪源性干细胞）（货号 R7788-115）
• L-谷氨酰胺-200mM (100X)，液体（货号25030-149、25030-164）或 CTS™ GlutaMAX™-I 添加剂（货号 A12860-01）
• 37°C 水浴
• 适当的组织培养容器和用品
• 低温储存容器和用品
• CTS™ CELLstart™ 底物（货号 A10142-01）
• 二甲基亚砜 (DMSO)（货号 D12345）
• CTS™ DPBS，含钙、镁离子（货号 A12858-01）
• CTS™（细胞治疗系统）DPBS，不含氯化钙，不含氯化镁（货号 A12856-01）
• 庆大霉素试剂溶液 (10 mg/mL)（货号15710-072）
• CTS™ TrypLE™ Select 酶（货号 A12859-01）
• CTS™ Synth-a-Freeze 培养基（货号 A13713-01）
  

对于无血清、无异种成分培养

• StemPro MSC SFM XenoFree（货号 A10675-01），由 StemPro MSC SFM 基础培养基和
• StemPro MSC SFM XenoFree 添加剂组成
• 庆大霉素 (50 mg/mL)，液体（货号15750-060）
  

对于无血清培养

• CTS™ StemPro MSC SFM（货号 A10332-01），由 CTS™ StemPro MSC SFM 基础培养基和 CTS™ StemPro MSC SFM 添加剂组成
  

对于从骨髓中分离 MSC

• 人骨髓穿刺液
• HBSS，含钙、镁离子，无酚红（货号 14025-134）
• 热灭活和混合 AB 人血清（货号34005-100）
• ACK 裂解缓冲液（货号 A10492-01）
• 梯度密度培养基（例如 GE Healthcare 的 Ficoll-Paque® PREMIUM 1.073）
• 台盼蓝溶液，0.4%（货号 15250-061）

用于无血清、无异种成分培养的 StemPro MSC SFM XenoFree 完全培养基（500 mL 完全培养基）

1. 在 2–8°C 下过夜解冻 StemPro MSC SFM XenoFree 添加剂（解冻的添加剂外观略微浑浊）。请勿在 37°C 下解冻。立即使用解冻材料或分装（即，1 mL）未使用的材料，并在 –20°C 至 –5°C 下储存。避免反复冻融。
   注：在 –20°C 至 –5°C 下冷冻储存时，StemPro MSC SFM XenoFree 添加剂可稳定储存12个月。
2. 要制备 500 mL StemPro MSC SFM XenoFree 完全培养基，请在无菌条件下混合下列组分：
   

    

   StemPro MSC SFM 基础培养基		490 mL
   StemPro MSC SFM XenoFree 添加剂		5 mL
   CTS™ GlutaMAX™-I 添加剂或 200 mM L-谷氨酰胺		5 mL（最终浓度 2 mM）
   可选：庆大霉素 (50 mg/mL)，液体		50 µL（最终浓度 5 µg/mL）

3. StemPro MSC SFM XenoFree 完全培养基可在 2–8°C 条件下避光储存最长2周。
   注：在使用前，请在室温下预热当天所需的完全培养基，直到触感不再冰凉。请勿在 37°C 下预热培养基。
    

原代分离培养基：含 2.5% 人 AB 血清的 StemPro MSC SFM XenoFree 完全培养基，用于分离骨髓中的 MSC（500 mL 完全培养基）

1. 在 2–8°C 下过夜解冻 StemPro MSC SFM XenoFree 添加剂（解冻的添加剂外观略微浑浊）。请勿在 37°C 下解冻。立即使用解冻材料或分装（即，1 mL）未使用的材料，并在 –20°C 至 –5°C 下储存。避免反复冻融。
   注：在 –20°C 至 –5°C 下冷冻储存时，StemPro MSC SFM XenoFree 添加剂可稳定储存12个月。
2. 要制备 500 mL StemPro MSC SFM XenoFree 完全培养基，请在无菌条件下混合下列组分：
   
   

   StemPro MSC SFM 基础培养基		477.5 mL
   StemPro MSC SFM XenoFree 添加剂		5 mL
   AB 人血清		12.5 mL（最终浓度 2.5%）
   CTS™ GlutaMAX™-I 添加剂或 200 mM L-谷氨酰胺		5 mL（最终浓度 2 mM）
   可选：庆大霉素 (50 mg/mL)，液体		50 µL（最终浓度 5 µg/mL）

   注：建议在使用前通过 0.22 µm 过滤器过滤 AB 人血清。

3. 含 2.5% 人 AB 血清的 StemPro MSC SFM XenoFree 完全培养基可在 2–8°C 条件下避光储存最长2周。
   注：在使用前，请在室温下预热当天所需的完全培养基，直到触感不再冰凉。请勿在 37°C 下预热培养基。

用于无血清培养的 StemPro MSC SFM CTS™ 完全培养基（500 mL 完全培养基）

1. 将 CTS™ StemPro MSC SFM 添加剂在 2–8°C 下解冻过夜。请勿在 37°C 下解冻。立即使用解冻材料或分装（即，15 mL）未使用的材料，并在 –20°C 至 –5°C 下避光储存。避免反复冻融。
   注：在 –20°C 至 –5°C 下避光冷冻储存时，CTS™ StemPro MSC SFM 添加剂可稳定储存12个月。
2. 要制备 500 mL StemPro MSC SFM XenoFree 完全培养基，请在无菌条件下混合下列组分：
   
   

   CTS™ StemPro MSC SFM 基础培养基	420 mL
   CTS™ StemPro MSC SFM 添加剂	75 mL
   CTS™ GlutaMAX™-I 添加剂或 200 mM L-谷氨酰胺	5 mL（最终浓度 2 mM）
   可选：10 mg/mL 庆大霉素试剂溶液	50 µL（最终浓度 5 µg/mL）

3. 在全部三种组分的有效期内，CTS™ StemPro MSC SFM 培养基可在 2–8°C 条件下避光储存最长4周。
   注：在使用前，请在室温下预热当天所需的完全培养基，直到触感不再冰凉。

使用 CTS™ CELLstart™ 底物包被培养容器

1. 按 1:100 的比例将 CTS™ CELLstart™ 稀释到含钙、镁离子的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) CTS™ 中（即，将 100 µL CTS™ CELLstart™ 底物加入 10 mL CTS™ DPBS 中），或者如果从骨髓中分离 MSC，则稀释到原代分离培养基中（即，将 100 µL CTS™ CELLstart™ 底物加入 10 mL 原代分离培养基中）。用移液管轻轻吹吸或上下颠倒混匀，请勿涡旋。向每个 T-75 培养瓶中加入 10 mL CTS™ CELLstart™ 底物溶液，并确保表面被完全覆盖。注：请勿储存稀释的 CTS™ CELLstart™ 底物溶液；每次使用前新鲜制备。
2. 在 36°C 至 38°C、含 4–6% CO₂ 的潮湿空气中孵育 60–120 分钟。孵育后，从培养箱中取出培养瓶，并暂时将其置于层流罩中，直至使用。临用前，去除所有 CTS™ CELLstart™ 底物溶液，并更换为完全培养基。使用前请勿冲洗包被培养板。注：如果 CTS™ CELLstart™ 底物包被培养板（板中有包被溶液）用 Parafilm 封口膜紧密包裹，可在 2°C 至 8°C 下储存2周。请勿在储存前去除包被溶液。
   

复苏冻存的人 MSC

注：这些说明可用于无血清和无异种成分培养，或通过在步骤3、5、6和8中加入适当的完全培养基，仅用于无血清培养。对于无血清、无异种成分培养，使用 StemPro MSC SFM XenoFree 完全培养基；对于无血清培养，使用 CTS™ StemPro MSC SFM 完全培养基。

1. 在 37°C 水浴中快速解冻（<1 分钟）冷冻的人 MSC 样品瓶，直至剩余少量冰。
2. 使用移液管将冻存管中的全部内容物吸移到一个 50 mL 无菌锥形管中。
   
3. 以约每2秒1滴的速率向锥形管中小心加入 5–10 mL 预热 (37°C) 的完全培养基，并在每次加入后轻轻涡旋，以确保细胞悬液的均一性。
   
4. 在室温下以 100–200 × g 离心锥形管5分钟。吸出上清液并弃去，小心不要扰动细胞沉淀。
   
5. 将细胞沉淀重悬于最小体积的预热 (37°C) 完全培养基中以进行细胞计数。使用 Countess 自动细胞计数仪（可选自动或手动程序）测定总活细胞密度。计算以 ≥ 5 × 10³ 个细胞/cm2 的密度接种细胞所需的细胞悬液体积。
   
6. 将细胞悬液加到含有 10–15 mL 预热完全培养基的适当 CTS™ CELLstart™ 底物包被培养瓶中（参见使用 CTS™ CELLstart™ 底物包被培养容器）。
   
7. 在 36°C 至 38°C、含 4%-6% CO₂ 的潮湿空气中孵育。
   
8. 每 2–3 天用新鲜预热的完全培养基替换培养瓶中的培养基。

从骨髓中分离 MSC

注：对于 MSC 的初始分离，补充含 2.5% 人 AB 血清的无血清、无异种成分完全培养基，有助于细胞贴壁和生长。对于后续传代，不需要人 AB 血清。

1. 将人骨髓穿刺液与 HBSS 按 1:2 混合（即，10 mL 穿刺液 + 20 mL HBSS）。
   
2. 将 15 mL 梯度密度培养基吸移到 50 mL 离心管中。
   
3. 将 20 mL 稀释的骨髓穿刺液慢慢铺在梯度密度培养基上面，注意不要将细胞和培养基混合。
   
4. 将离心管在 20°C 下以 400 x g 离心35分钟（关闭离心机制动器）。
   
5. 用无菌移液器或 1 mL 血清移液器小心移取单核细胞 (MNC) 层。
   注：为了成功分离人 MSC，必须避免红细胞 (RBC) 污染，因为红细胞会影响 MSC 贴壁和增殖。
   
6. 向含收获 MNC 的试管中加入 30 mL HBSS，用移液管解离细胞沉淀。
   
7. 以 400–500 × g 离心10分钟。去除上清液。
   
8. 重复步骤7。
   
9. 将细胞重悬于最小体积的原代分离培养基（含 2.5% 人 AB 血清的 StemPro MSC SFM XenoFree 完全培养基）中。
   
10. 将 25 μL 细胞溶液转移至微量离心管中，并加入 50 μL ACK 裂解缓冲液进行 RBC 裂解。
    
11. 用移液管吸取细胞溶液进行混合并在室温下孵育5分钟。
    
12. 用台盼蓝溶液按 1:2 的比例稀释细胞裂解液。
    
13. 使用 Countess 自动细胞计数仪或其他首选方法（如血细胞计数器）进行细胞计数。
    
14. 使用原代分离培养基稀释底物，以 2.67 x 10⁵ 个细胞/cm² 的密度将活 MNC 接种到 CTS™ CELLstart 底物包被培养瓶中。
    
15. 3–4 天之后，收获上清液，然后以 300 x g 离心5分钟。
    
16. 向培养瓶中加入预热的原代分离培养基。
    
17. 每两天更换一次完全原代分离培养基。
    注：更换初始培养基后，不需要进行上清液细胞收获。
    
18. 达到 70–80% 融合度后，在无血清条件下增殖细胞，如下所述。

MSC 传代

通用指南

对于无异种成分、无血清培养：

• 开发的 StemPro MSC SFM XenoFree 旨在以大于克隆密度（≥ 5 × 103 个细胞/cm2）多代扩增人骨髓源性 MSC 和脂肪源性干细胞 (ADSC)。降低接种密度可能导致细胞扩增欠佳，必须确定每种应用的最佳生长条件。
• 如果在 StemPro MSC SFM XenoFree 中传代人 MSC，则起始细胞融合度应达到 60–90%，细胞活力应至少为 90%，且传代培养前生长速率应处于对数中期。初始培养条件不理想可能会影响产品性能。将 MSC 或 ADSC 从含血清的培养基过渡到 StemPro MSC SFM XenoFree 不需要适应性方案。
• 为获得最佳性能，每2天使用 StemPro MSC SFM XenoFree 完全培养基对培养物重新补料一次。

注：以下详述程序适用于在 T-75 培养瓶 (75 cm2) 中维持培养。根据所需容器大小调整用量（参见表1：试剂用量）。

对于无血清培养：

• 开发的 CTS™ StemPro MSC SFM 旨在以高于克隆密度对人骨髓源性 MSC 和 ADSC 进行原代分离和多代扩增，在 ≥ 5 × 10³ 个细胞/cm² 时观察到最佳细胞扩增。
  
• 降低接种密度可能导致细胞扩增欠佳。必须确定每种应用的最佳生长条件。
  
• 建议在细胞融合度达到 60–80%、细胞处于对数生长中期且细胞活力至少为 90% 时，对 CTS™ StemPro MSC SFM 中的人 MSC 进行传代培养。初始培养条件不理想可能会影响产品性能。将 MSC 或 ADSC 从含血清的培养基过渡至 CTS™ StemPro MSC SFM 完全培养基无需适应性方案。
  
• 为了获得最佳性能和细胞生长，应每2天使用新鲜的 CTS™ StemPro MSC SFM 完全培养基对培养物进行重新补料。

注：以下详述程序适用于在 T-75 培养瓶 (75 cm2) 中维持培养。根据所需容器大小调整用量（参见表1：试剂用量）。

表2 试剂用量

MSC 增殖

1. 用倒置显微镜观察储备培养瓶（细胞在当前培养基配方或完全培养基中的生长情况），并确认细胞可供传代（无异种成分、无血清培养基中约 60–90% 融合度，无血清培养基中约 60–80% 融合度）。
   
2. 使用前预热 CTS™ TrypLE™ Select 试剂（货号 12859）及适用的完全培养基。
   
3. 对于收获的每个培养瓶，向 50 mL 锥形管中加入 10 mL 预热的完全培养基。
   
4. 从 T-75 培养瓶中吸出用过的培养基并弃去。
   
5. 使用 5–10 mL 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 CTS™ DPBS 洗涤细胞单层表面，吸出并弃去。
   
6. 向 T-75 培养瓶中加入 3–5 mL CTS™ TrypLE™ 试剂，向各方向倾斜培养瓶，确保完全覆盖细胞单层。在 37°C 下，将细胞在 CTS™ TrypLE™ 试剂中孵育 2-10 分钟。
   注：来自含血清培养基中的细胞可能需要更长的孵育时间（5-10 分钟），而在无血清条件下生长的细胞应更容易解离（2-3 分钟）。
   
7. 孵育后，采用倒置显微镜检查培养瓶中的细胞解离情况。根据需要用力敲击培养瓶，以促进细胞完全解离。
   
8. 解离后，向每个培养瓶中加入 5 mL 预热的 StemPro MSC SFM XenoFree（用于无异种成分、无血清培养）或 5 mL 预热的含钙、镁离子的 CTS™ DPBS（用于无血清培养），以完全覆盖表面区域。将细胞悬液转移至含有相应完全培养基的 50 mL 无菌锥形管中。用力敲击培养瓶，用 5 mL 适当的完全培养基重新洗涤，并收集。
   注：向收获的细胞中加入完全培养基对于防止细胞在离心过程中粘附在锥形管壁上至关重要。
   
9. 在室温下以 100–200 × g 离心锥形管5分钟。吸出培养基并弃去，小心不要扰动细胞沉淀。
   
10. 使用首选计数方法（例如 Countess 自动细胞计数仪），将细胞沉淀重悬于最小体积的预热完全培养基中进行细胞计数。
    
11. 去除每个包被培养瓶中的 CTS™ CELLstart™ 底物溶液，加入 15 mL 完全培养基。
    
12. 向每个培养瓶中加入足够的细胞悬液，以使细胞密度达到 ≥ 5 × 10³ 个细胞/cm²（即，每个 T-75 培养瓶中有 3.75 × 10⁵ 个活细胞）。轻轻混合或涡旋细胞悬液，以确保均匀分布。
    
13. 将培养瓶放入 37˚C、含 4–6% CO2 潮湿空气的培养箱中。
    

为获得最佳性能和细胞生长，每 2-3 天用预热的完全培养基替换用过的培养基。

冻存 MSC

1. 根据培养类型在使用当天制备冻存溶液或使用 CTS™ Synth-a-Freeze 培养基：
   

   a. 对于无异种成分、无血清培养：向 StemPro MSC SFM XenoFree 完全培养基中加入 20% 二甲基亚砜 (DMSO)，制备 10 mL XFM 冻存溶液 (2X)。使用前在 4°C 下储存。
   

   StemPro MSC SFM 基础培养基		7.9 mL
   StemPro MSC SFM XenoFree 添加剂		0.1 mL（最终浓度 1%）
   二甲基亚砜		2.0 mL（最终浓度 20%）

   b. 对于无血清培养：使用当天，向 CTS™ StemPro MSC SFM 基础培养基中添加 25% CTS™ StemPro MSC SFM 添加剂和 10% 二甲基亚砜 (DMSO)，制备 10 mL SFM 冻存溶液。使用前在 4°C 下储存。
   

   CTS™ StemPro MSC SFM 基础培养基		6.5 mL
   CTS™ StemPro MSC SFM 添加剂		2.5 mL（最终浓度 25%）
   二甲基亚砜		1 mL（最终浓度 10%）

2. 根据 MSC 增殖的步骤 1-8，使用适当的完全培养基收获细胞进行冻存。
3. 在 0.5 mL 预热的完全培养基中复溶收获的细胞沉淀至预期最终细胞浓度的两倍（即，2 × 10⁶ 个细胞/mL）。向细胞悬液中缓慢加入 0.5 mL 冷 XFM 或 SFM 冻存溶液 (2X)，轻轻混匀，确保细胞分布均匀。如果您使用 CTS™ Synth-a-Freeze 培养基，请将细胞沉淀重悬至所需的最终浓度（1 x 10⁶ 个细胞/mL），并遵循以下步骤 4-6。
   
4. 立即向冻存管中加入所需用量的细胞悬液（即，1 mL）。
   
5. 按照标准程序使用自动或手动控制速率的冷冻装置（每分钟降低 1°C），并将冻存管置于 –70°C 的低温冷冻容器（例如 Mr. Frosty® (1°C) 冷冻容器）中。
   
6. 24小时后，将冷冻细胞转移至液氮（气相）中；建议在 –200°C 至 –125°C 下储存。

在无异种成分条件下维持三系分化潜能

使用 StemPro MSC SFM XenoFree，人 MSC 或 ADSC 可以多次传代扩增并保持其多向分化潜能表型（即，分化为成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞谱系的能力）（图3）。

图3.在无异种成分条件下培养的人 MSC 的表征。在 (A) DMEM（低糖）+ 10% 经 MSC 验证的 FBS 或 (B) StemPro MSC SFM XenoFree + CTS™ CELLstart™ 底物包被培养板中扩增的人骨髓源性 MSC 表现出三系中胚层分化潜能，如油红 O 染色（脂肪细胞）、阿利新蓝染色（软骨细胞）和碱性磷酸酶染色（成骨细胞）所示。显示的数据 = 第3代（起始人 MSC = 第5代，4供体池，10x 物镜）。分化试剂 = StemPro 分化试剂盒（脂肪生成、软骨生成、骨生成）。(C) 使用多重流式细胞术分析的第5代人 MSC 显示，在含 10% FBS 的经典培养基或 StemPro MSC SFM XenoFree 中扩增后，保留了特征性人 MSC 表面抗原谱。NEG = 对 CD14、CD19、CD45 和 HLA-DR 进行多重分析。

在无血清和无异种成分条件下维持三系分化潜能

使用 CTS™ StemPro MSC SFM，人 MSC 或 ADSC 可以多次传代扩增并保持其三系中胚层分化潜能（即，分化为成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞谱系的能力）（图4）。

图4. 在 StemPro MSC SFM 中培养的 hMSC 经过长期传代仍保持三系分化潜能。将在 StemPro MSC SFM 中培养的 hMSC（第5代后）接种到成脂肪、成软骨或成骨分化培养基中，培养14天，显示出脂肪细胞（油红 O 脂质染色）、软骨细胞（阿利新蓝糖胺聚糖染色）和成骨细胞（碱性磷酸酶染色）。

在无血清和无异种成分条件下培养的 hMSC 的形态

在经典培养基中培养的人 MSC 具有扁平的细胞形态，并在 1.0–3.0 x 10⁴ 个细胞/cm² 时达到融合，而 StemPro MSC SFM 中培养的人 MSC 具有更小的梭形形态，密度可达 >1.0 x 10⁵ 个细胞/cm²（图5）。

1. Lindroos B et al.(2009) Serum-free, xeno-free culture media maintain the proliferation rate and multipotentiality of adipose stem cells in vitro.Cytotherapy 11(7):958–972.
2. Sugii S et al.(2010) Human and mouse adipose-derived cells support feeder-independent induction of pluripotent stem cells.Proc Natl Acad Sci U S A 107(8):3558–3563.
3. Chase LG, et al.(2013) Development and characterization of a clinically compliant xeno-free culture medium in good manufacturing practice for human multipotent mesenchymal stem cells.Stem Cells Transl Med 1:750–758.
4. Chase L et al.(2010) A novel serum-free medium for the expansion of human mesenchymal stem cells.Stem Cell Res Ther 1:8 doi:10.1186/scrt8.
5. Agata H et al.(2009) Feasibility and efficacy of bone tissue engineering using human bone marrow stromal cells cultivated in serum-free conditions.Biochem Biophys Res Commun 382(2):353–358.
6. Ng F et al.(2008) PDGF, TGF-beta, and FGF signaling is important for differentiation and growth of mesenchymal stem cells (MSCs): transcriptional profiling can identify markers and signaling pathways important in differentiation of MSCs into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages.Blood 112(2):295–307.
   

最近更新：2014年3月17日