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介绍

小鼠胚胎干细胞 (mESC) 是来源于囊胚（早期胚胎）内细胞团的多能干细胞1,2。胚胎干细胞不同于其他细胞的两个独特特性是其具有多能性及其在特定条件下自我更新的能力。它们具有多能性，能够分化成初级胚层的所有衍生物，包括外胚层、内胚层和中胚层，从而生成机体的各种细胞类型。小鼠 ESC 还可以在具有完整胚胎的嵌合体中分化成各种成体组织，包括生殖细胞。

重组白血病抑制因子 (LIF) 是一种可在细胞培养应用中诱导巨噬细胞分化的生物活性蛋白。

需要的材料

  • Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)，高糖，含丙酮酸盐（货号 11995-065）
  • 经 ESC 验证的胎牛血清 (FBS)（货号 10439-024）
  • 附着因子（货号 S006100）
  • MEM 非必需氨基酸溶液，10 mM（货号 11140-050）
  • KnockOut™ 血清替代物 (KSR)（货号 10828-028）
  • KnockOut™ DMEM（货号 10829-018）
  • 重组人 LIF（白血病抑制因子），10 μg（货号 PHC9464）
  • Gibco 小鼠胚胎成纤维细胞（经辐照），冷冻（货号 S1520-100）或经丝裂霉素 C 处理的 MEF
  • GlutaMAX™-I (100X)（货号 35050-079）
  • Gibco 小鼠胚胎干细胞 (mESC)，~1 × 106 个细胞/瓶（货号 S1503-100）
  • 不含钙、镁离子的 Dulbecco's PBS (DPBS)（货号 14190-144）
  • StemPro Accutase 细胞解离试剂（货号 A11105-01）
  • β-巯基乙醇，1000X（货号 21985-023）
  • 37°C 水浴
  • 适当的组织培养板和用品

制备培养基与材料

10 μg/mL 重组人白血病抑制因子 (LIF) (1000 μL)

  1. 打开 LIF 样品瓶前先短暂离心，使内容物沉降至底部。
  2. 要制备 1 mL 10 μg/mL LIF 溶液，请在无菌条件下混合下列组分：

    组分 用量
    LIF10 μg
    不含钙、镁离子的 DPBS 989 μL
    0.1% KnockOut™ 血清替代物 (KSR)1 μL
  3. 分装，在 -20°C 条件下可储存最长6个月。

MEF 培养基（100 mL 完全培养基）

  1. 要制备 100 mL MEF 完全培养基，请在无菌条件下混合下列组分：

    组分 用量
    DMEM89 mL
    经 ESC 验证的 FBS10 mL
    MEM 非必需氨基酸溶液，10 mM1 mL
    β-巯基乙醇，1000X100 μL
  2. MEF 完全培养基可在 2–8°C 条件下储存最长1周。

小鼠胚胎干细胞 (mESC) 培养基（100 mL 完全培养基）

  1. 要制备 100 mL mESC 完全培养基，请在无菌条件下混合下列组分：

    组分 用量
    KnockOut™ DMEM83 mL
    KnockOut™ 血清替代物 (KSR)15 mL
    MEM 非必需氨基酸溶液，10 mM1 mL
    GlutaMAX™-I1 mL
  2. mESC 完全培养基可在 2–8°C 条件下储存最长1周。
  3. 使用培养基之前，请加入下述组分并混匀：

    组分 用量
    LIF（10 μg/mL 储备液）100 μL（最终浓度 = 10 ng/mL）
    β-巯基乙醇，1000X100 μL


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制备 MEF 培养皿

AF 包被的培养容器

  1. 用附着因子 (AF) 溶液覆盖每个新培养容器的整个表面，并将容器在 37°C 下孵育30分钟或在室温下孵育2小时。
  2. 在层流培养罩中采用无菌操作，临用前通过抽吸完全去除培养容器中的 AF 溶液。包被容器可立即使用或在室温下储存不超过24小时。
    注：在加入细胞或培养基之前，无需洗涤培养表面。

MEF 解冻和铺板

注：必须在开始 mESC 培养或传代前 3-4 天用有丝分裂失活的 MEF 铺板。

  1. 使用金属镊子从液氮储存设备中取出有丝分裂失活的 MEF 样品瓶。
  2. 戴手套滚动样品瓶，直至外部无霜。该过程需要约 10–15 秒。
  3. 将样品瓶浸入 37°C 水浴中，不要浸没瓶盖。轻轻涡旋样品瓶。
  4. 当仅剩余一块冰晶时，从水浴中取出样品瓶。
  5. 用 70% 乙醇喷洒样品瓶外部，并将其置于通风橱中。
  6. 使用移液管将解冻的细胞轻轻移至 15 mL 无菌锥形管中。
  7. 向 15 mL 锥形管内的细胞中缓慢逐滴加入 4 mL 预热的 MEF 培养基。添加培养基时，来回轻轻晃动锥形管以混匀 MEF。这可减少细胞的渗透压休克。
  8. 用 1 mL 预热 MEF 培养基冲洗样品瓶，然后加至含有细胞的 15 mL 锥形管中。
  9. 以 200 × g 离心细胞5分钟。
  10. 吸出上清液。将细胞沉淀重悬于 MEF 培养基中，使细胞密度达到约 2.5 × 106 个细胞/mL。
  11. 从预包被培养容器中吸出 AF 溶液。
  12. 在每个预包被培养容器中加入适量 MEF 培养基（请参见表1）。
  13. 在这些培养容器中，加入适量 MEF 悬液（参见表1）。
    注：有丝分裂失活 MEF 的推荐铺板密度为 8 × 104 个细胞/cm2。
  14. 以划8字的方式快速移动培养容器数次，将细胞分散于容器表面。
  15. 将 MEF 培养容器放入 37°C、5% CO2 培养箱中。
  16. 在铺板后3-4天内使用 MEF 培养容器。

表1失活 MEF 的所需用量

培养容器 表面积 (cm2) MEF 的数量 最佳用量 (mL)
6孔板10 cm2/孔8.0 × 105/孔2 mL/孔
12孔板4 cm2/孔3.2 × 105/孔1 mL/孔
24孔板2 cm2/孔1.6 × 105/孔0.5 mL/孔
35 mm 培养皿10 cm28.0 × 1052 mL
60 mm 培养皿20 cm21.6 × 1064 mL
100 mm 培养皿60 cm24.8 × 10612 mL

图1有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 铺于用附着因子包被的培养容器上，铺板后4天的细胞如图所示。

 

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mESC 解冻和铺板

  1. 从含有失活 MEF 的培养皿中吸出 MEF 培养基，并在 mESC 铺板前 3–4 小时向培养皿中加入预热的 mESC 培养基。
  2. 在含有失活 MEF 细胞的培养皿上标记样品瓶的传代次数、日期和用户姓名首字母。
  3. 使用金属镊子从液氮储存设备中取出 mESC 样品瓶。
    注：如果样品瓶从取出至解冻暴露于环境温度超过15秒，则将样品瓶转移至含有少量液氮的容器中。
  4. 戴手套滚动样品瓶，直至外部无霜。该过程需要约 10–15 秒。
  5. 将样品瓶浸入 37°C 水浴中，不要浸没瓶盖。轻轻涡旋样品瓶。
  6. 当仅剩余一块冰晶时，从水浴中取出样品瓶。
  7. 用 70% 乙醇喷洒样品瓶外部，并将其置于通风橱中。
  8. 使用 5 mL 无菌移液器，将细胞轻轻移至 50 mL 无菌锥形管中。
  9. 向 50 mL 锥形管中的细胞中缓慢逐滴加入 10 mL mESC 培养基。添加培养基时，来回轻轻晃动锥形管以混匀 mESC。这可减少细胞的渗透压休克。
  10. 用 1 mL mESC 培养基冲洗样品瓶，然后加至含有细胞的 50 mL 锥形管中。
  11. 将细胞悬液转移至 15 mL 锥形管中，然后以 200 × g 离心细胞5分钟。
  12. 吸出上清液，将细胞沉淀重悬于适量的预热 mESC 培养基中。
  13. 取出 20 μL 细胞悬液，采用台盼蓝拒染法，手动进行活细胞计数。
    注：如果冻存前在 MEF 饲养层上培养 mESC，则冷冻的 mESC 样品瓶中也可能含有 MEF。由于自动细胞计数仪无法区分 mESC 和 MEF，我们建议手动进行活细胞计数。mESC 较饲养层细胞更小更圆，形状更均一。
  14. 根据表2，通过用移液器在锥形管中轻轻上下吹吸细胞数次，将细胞沉淀重悬于足量的 mESC 培养基中。
  15. 从 MEF 培养皿中吸出用过的 mESC 培养基，并将解冻的集落以大约 4 × 104 个细胞/cm2 的铺板密度缓慢加入培养皿中。
  16. 将培养皿轻轻放入 37°C、5% CO2 培养箱中。以划8字的方式快速移动培养皿数次，将细胞分散于培养皿表面。
  17. 孵育细胞过夜。
  18. 第二天，使用无菌血清移液管去除用过的培养基及碎片，并将其转移至制备的 MEF 培养皿中。如果主培养皿有问题，您可以使用此培养皿作为备份。
  19. 根据表2中的用量向每个培养皿中加入新鲜的 mESC 培养基。将两块培养板轻轻放入 37°C、5% CO2 培养箱中过夜。

    表2所需的 mESC 培养基用量
    培养容器 表面积 (cm2) mESC 的数量 mESC 培养基
    6孔板10 cm2/孔4.0 × 105/孔2 mL/孔
    12孔板4 cm2/孔1.6 × 105/孔1 mL/孔
    24孔板2 cm2/孔8 × 104/孔0.5 mL/孔
    35 mm 培养皿10 cm24.0 × 1052 mL
    60 mm 培养皿20 cm28.0 × 1054 mL
    100 mm 培养皿60 cm22.4 × 10612 mL
  20. 在显微镜下检查细胞，并每天更换两块培养板中用过的培养基。如果对超过一块培养板加料，则为每个孔使用不同的移液器，以降低污染风险。在一周内可能无法观察到集落。
图2. 在含 KSR 的 mESC 培养基中的有丝分裂失活 MEF 饲养层上培养的第21代小鼠 (C57BL/6) ESC。铺板后2天以 10X 物镜观察到的图像。

 

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mESC 传代

何时分传细胞

通常，在出现以下情况之一时，分传细胞：

  • mESC 集落太密集或太大。
  • 分化增强。

分传比例

  • 分传比例可能有所不同，但通常在 1:3 和 1:8 之间。有时，细胞生长速度不同，需要调节分传比例。一般规则是遵循上次分传比例，并根据 mESC 集落的外观调整该比例。
  • 如果细胞健康且集落间隔足够，则采用相同的分传比例。如果它们过于密集和拥挤，则提高该比例。如果细胞稀疏，则降低该比例。根据外观，细胞需要每 4-10 天分传一次。
  • mESC 在用 mESC 培养基处理的 MEF 培养板中生长良好。惯例是在 mESC 传代之前，准备好新的饲养层培养板。
图3.可供传代的 mESC 集落。注意集落较大且集落彼此非常靠近。

 

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使用 StemPro Accutase 溶液进行酶传代

  1. 从含有失活 MEF 的培养皿中吸出 MEF 培养基，并在 mESC 铺板前 3–4 小时向培养皿中加入预热的 mESC 培养基。
  2. 在新的 MEF 培养皿上标记细胞系名称、新的传代次数、日期、分传比例和用户姓名首字母。将培养皿放回培养箱中。
  3. 在解剖显微镜下，从待传代的 mESC 培养皿中取出任何分化的集落。
  4. 用巴斯德吸管从培养皿中吸出用过的培养基，并用不含钙、镁离子的 Dulbecco’s PBS (DPBS) 冲洗培养皿一次。推荐用量请参见表3。
  5. 吸出 DPBS，将 StemPro Accutase 溶液加入含 mESC 细胞的培养皿中。根据不同的培养皿尺寸调整 StemPro Accutase 溶液的用量（请参见表3）。

    表3试剂用量（mL/孔或 mL/培养皿）

    培养容器 表面积 DPBS StemPro Accutase 溶液 mESC 培养基
    6孔板10 cm2/孔2 mL/孔1 mL/孔2 mL/孔
    12孔板4 cm2/孔1 mL/孔0.5 mL/孔1 mL/孔
    24孔板2 cm2/孔0.5 mL/孔0.3 mL/孔0.5 mL/孔
    35 mm 培养皿10 cm22 mL1 mL2 mL
    60 mm 培养皿20 cm24 mL2 mL4 mL
    100 mm 培养皿60 cm212 mL5 mL12 mL
  6. 将培养皿在 37°C、5% CO2 培养箱中孵育 1–2 分钟，直至单个细胞开始变圆。轻轻敲击培养容器的侧面，使大部分细胞从培养容器表面解离。
  7. 向每个培养皿中加入适量的 mESC 培养基，以停止解离反应。用移液管轻轻上下吹吸分离的 mESC，使集落分散成单细胞悬液。确保轻轻吹吸，以尽量减少气泡的形成。
  8. 将 mESC 悬液转移至 15 mL 锥形管中，然后以 250 × g 离心试管5分钟以使细胞沉淀。
  9. 从 mESC 沉淀中小心吸出上清液。
  10. 用适量 mESC 培养基重悬沉淀（请参见表3）。这取决于分传比例和所用培养皿的数量。
  11. 用 10 mL 移液器混匀细胞悬液。请小心不要使培养基中产生气泡。
  12. 向每个培养皿中加入适量细胞悬液。将培养皿放回培养箱中。
  13. 以划8字的方式快速移动培养皿数次，将细胞分散于培养皿表面。
  14. 将细胞在 37°C、5% CO2 培养箱内孵育过夜。每天更换用过的培养基。
    注：当细胞贴壁培养时，打开和关闭培养箱门时应小心，避免影响细胞在孔表面的均匀分布。

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附录

A. 在 mESC 培养基中，KnockOut™ DMEM（货号 10829-018）可替换为以下替代物：

KnockOut™ DMEM/F-12（货号 12660-012）

如需使用 KnockOut™ DMEM/F-12 制备 100 mL mESC 完全培养基，请在无菌条件下混合下表中列出的组分。

组分 储备液浓度 最终浓度 用量
KnockOut™ DMEM/F-12（货号 12660-012）—1X83 mL
KnockOut™ 血清替代物 (KSR)
（货号 10828-028）		—15%15 mL
GlutaMAX™-I（货号 35050-061）200 mM2 mM1 mL
MEM 非必需氨基酸溶液（货号 11140-050）10 mM0.1 mM1 mL
LIF（货号 PHC9464）10 μg/mL10 ng/mL100 μL
β-巯基乙醇（货号 21985-023）1000X1X100 μL

B. 用于收获 mESC 的解离酶/工具

解离酶/工具 应用 建议浓度
TrypLE™ Express（货号 12604-021）解离成单细胞1X 即用型

参考文献

  1. Evans, M., Kaufman, M. (1981) Establishment in culture of pluripotent cells from mouse embryos.Nature 292, 154–156.
  2. Martin, G. (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.Proc Natl Acad Sci USA 78, 7634–7638. 

MAN0007198         2012年8月22日

仅供研究使用。不得用于人或动物的任何治疗或诊断用途。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。