使用 KnockOut™ 血清替代物无饲养层完全培养基从 iPSC 中生成拟胚体

• 无菌组织培养通风橱
• 设置为 37°C 的培养箱
• 移液辅助器
• 设置为 37°C 的水浴
• 无菌血清移液器（5 mL、10 mL）
• 15 mL 离心管
• 60 mm 经组织培养处理的培养皿
• 60 mm 或 100 mm 未经组织培养处理的培养皿

1. 要制备 100 mL KnockOut™ 血清替代物 EB 完全培养基，请在无菌条件下混合下表中列出的组分。
   
   

   组分	储备液浓度	最终浓度	用量
   Knockout™ DMEM/F12（货号 12660-012）	-	1X	78 mL
   GlutaMAX™ -I（货号 35050-061）	200 mM	2 mM	1 mL
   KnockOut™ SR（货号 10828-028）	-	20%	20 mL
   非必需氨基酸（货号 11140-076）	10 mM	0.1 mM	1

   
   注：KSR EB 培养基可在 2-8°C 下制备并储存最长2周。
   
   
2. 在对完全培养基预先进行温度和气体平衡之前，先在无菌条件下加入所需用量的 2-巯基乙醇（55 mM 储备液浓度），使最终浓度为 0.1 mM。例如，要制备 100 mL KSR-FF 培养基，加入 182 μL 55 mM 2-巯基乙醇（1:550 稀释）；或者，可将 2-巯基乙醇加入 1X 完全培养基中，并在 2–8°C 下储存最长1周。
3. 将当天所需的适量（见表1）KSR EB 培养基分装至预热至 37°C 的离心管中。
   

1. 在显微镜下观察在无 KSR 饲养层完全培养基中生长的人 iPSC，确认细胞达 70-80% 融合度，可进行传代培养。
   
   注：如果集落过密或过大，则分化增强。
   
   
2. 在传代培养物之前，切下并去除任何分化的 iPSC 或 hESC 集落。
3. 在 37 °C 水浴中预热所需用量的分散酶。有关所需用量的详细信息，请参见下表1。
4. 在 37°C 水浴中预平衡所需用量的 KSR-EB 培养基15分钟。有关所需用量的详细信息，请参见下表1。
5. 用移液器从培养皿中吸出用过的培养基，并用 D-PBS 冲洗细胞两次。
6. 向培养皿中轻轻加入预热的分散酶溶液（例如，每 60 mm 培养皿加入 1 mL 分散酶溶液）。涡旋培养皿以包被整个细胞表面。
7. 将培养皿在 37°C 下孵育3分钟。
8. 从培养箱中取出培养皿，吸出分散酶溶液，并用 D-PBS 轻轻洗涤细胞。
9. 使用细胞刮刀将细胞从培养皿表面轻轻刮下，并将细胞转移至 15 mL 无菌离心管中。
10. 用 DPBS 冲洗培养皿两次，轻轻“冲下”任何未解离的细胞。将冲洗液与细胞合并至 15 mL 试管中。
11. 在室温下以 200 × g 离心试管5分钟，使细胞沉淀。
12. 在不扰动细胞沉淀的情况下小心吸出上清液并弃去。
13. 轻弹试管，使细胞沉淀完全脱离试管底部。
14. 使用 5 mL 血清移液器将细胞轻轻重悬于预平衡的 KSR-EB 完全培养基中。切勿捣碎。注：本步骤的关键是轻轻重悬细胞，切勿用力，以免损伤细胞。
15. 可将一个 60 mm 培养皿的细胞转移至一个 60 mm EB 培养皿或一个 100 mm EB 培养皿中。将细胞接种于 60 mm 或 100 mm 未经组织培养处理的培养皿上。
16. 将培养皿置于 37°C、含 4-6% CO₂ 潮湿空气的培养箱中。
17. 每隔一天更换一次 EB 培养基，方法是吸出培养皿中的全部培养基，并将其转移到离心管中。将该离心管放在通风橱中，让细胞沉降至管底（约5分钟）。然后，使用移液器吸出离心管中的上清液，将其替换为新鲜平衡的 KSR EB 培养基。将细胞放回同一培养皿中。
18. 继续每隔一天更换一次培养基。EB 将随时间不断生长。
19. 或者，4天后，将细胞等分转移至 2 x 100 mm 经组织培养处理的培养皿中进行贴壁。EB 贴壁可进一步将细胞分化为各种细胞类型。
20. 随着时间的推移，以相同的时间表进行换液，但是随着细胞的扩增，每皿的培养基量可能需要增加 50% 或 100%。
21. 让细胞增殖14天和21天，或更长时间。可以收获整个 EB 培养皿进行分析。

图1：不同时间点（第3天、第7天、第9天和第16天）的拟胚体（放大倍数均为40倍）。球体逐渐变成细胞团，转移到经组织培养处理的培养皿后将最终贴壁和分化。

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