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小鼠胚胎干细胞 (mESC) 是来源于囊胚(早期胚胎)内细胞团的多能干细胞1,2。胚胎干细胞不同于其他细胞的两个独特特性是其具有多能性及其在特定条件下自我更新的能力。它们具有多能性,能够分化成初级胚层的所有衍生物,包括外胚层、内胚层和中胚层,从而生成机体的各种细胞类型。小鼠胚胎干细胞(mESC) 还可以在具有完整胚胎的嵌合体中分化成各种成体组织,包括生殖细胞。
通过将 小鼠胚胎干细胞(mESC) 铺于未经组织培养处理的培养皿中以防止贴壁,正常传代后生成拟胚体 (EB)。EB 可用于测试细胞的分化潜能。
组分 | 用量 |
---|---|
KnockOut™ DMEM | 83 mL |
KnockOut™ 血清替代物 (KSR) | 15 mL |
MEM 非必需氨基酸溶液,10 mM | 1 mL |
GlutaMAX™-I | 1 mL |
组分 | 用量 |
---|---|
mESC EB 培养基 | 90 mL |
FBS | 10 mL |
在 EB 培养第4天时需要使用附着因子 (AF) 培养皿。为您计划生成的每份 mESC EB 样品制备一个 AF 包被培养板。
培养容器 | 表面积 | DPBS | StemPro Accutase 溶液 | mESC EB 培养基 |
---|---|---|---|---|
6孔板 | 10 cm2/孔 | 2 mL/孔 | 1 mL/孔 | 2 mL/孔 |
12孔板 | 4 cm2/孔 | 1 mL/孔 | 0.5 mL/孔 | 1 mL/孔 |
24孔板 | 2 cm2/孔 | 0.5 mL/孔 | 0.3 mL/孔 | 0.5 mL/孔 |
35 mm 培养皿 | 10 cm2 | 2 mL | 1 mL | 2 mL |
60 mm 培养皿 | 20 cm2 | 4 mL | 2 mL | 4 mL |
100 mm 培养皿 | 60 cm2 | 12 mL | 5 mL | 12 mL |
使用免疫细胞化学染色评价小鼠胚胎干细胞(mESC) 分化为三个初级胚层的能力。使用抗中胚层标志物平滑肌肌动蛋白、外胚层标志物 βIII-微管蛋白和内胚层标志物甲胎蛋白的抗体对分化细胞(第14天)进行染色(参见表2)。
表2表型标志物
胚层 | 抗原 | 来源 | 稀释比例 | 抗体类型 |
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外胚层 | βIII-微管蛋白 | Sigma,货号 T8660 | 1:1000 | 小鼠 IgG2b |
内胚层 | 甲胎蛋白 (AFP) | R&D Systems,货号 AF5369 | 1:200 | 山羊 IgG |
中胚层 | 平滑肌肌动蛋白 | 货号 08-0106 | 1:1 | 小鼠 IgG1-κ |
组分 | 用量 |
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不含钙、镁离子的 DPBS | 7.2 mL |
山羊血清 | 0.5 mL |
1% Triton X-100 | 0.3 mL |
50 mg/mL BSA | 2.0 mL |
组分 | 用量 |
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DAPI | 10 mg |
二甲基亚砜 | 10 mL |
A. 在 mESC EB 培养基中,KnockOut™ DMEM(货号 10829-018)可替换为以下替代物:
如需使用 KnockOut™ DMEM/F-12 制备 100 mL mESC EB 完全培养基,请在无菌条件下混合下表中列出的组分。
组分 | 储备液浓度 | 最终浓度 | 用量 |
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KnockOut™ DMEM/F-12(货号 12660-012) | — | 1X | 83 mL |
KnockOut™ 血清替代物 (KSR) (货号 10828-028) | — | 15% | 15 mL |
GlutaMAX™-I(货号 35050-061) | 200 mM | 2 mM | 1 mL |
MEM 非必需氨基酸溶液(货号 11140-050) | 10 mM | 0.1 mM | 1 mL |
解离酶/工具 | 应用 | 建议浓度 |
---|---|---|
TrypLE™ Express(货号 12604-021) | 解离成单细胞 | 1X 即用型 |
MAN0007199 2012年8月22日
仅供研究使用。不得用于人或动物的任何治疗或诊断用途。
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