在 Essential 8 培养基中培养多能干细胞 (PSC)

Essential 8™ 培养基是一种成分完全明确的无饲养层培养基，专为人多能干细胞 (PSC) 的生长和扩增而配制。Essential 8™ 培养基最初由 James Thomson 实验室的 Chen 等人¹所开发并经 Cellular Dynamics International 所验证，目前已经得到了广泛的测试并证明可维持多种 PSC 细胞系的多能性。与大多数无饲养层培养基不同，Essential 8™ 培养基无需会导致批间差异的 BSA（牛血清白蛋白）或 HSA（人血清白蛋白）。此外，大多数无血清培养基由20多种成分组成，增加了复杂性、时间和成本，而 Essential 8™ 培养基仅由8种成分组成。Essential 8™ 完全培养基通过将 Essential 8™ 添加剂 (50X) 添加到随产品提供的 Essential 8™ 基础培养基中制备而成。

人 PSC 在 Essential 8™ 完全培养基中的标准自然生长条件为 37°C、含 5% CO₂ 的潮湿环境。培养物在玻连蛋白包被的经组织培养处理容器中的 Essential 8™ 完全培养基中生长，必须使用 EDTA 进行传代。与在其他无饲养层培养基中相比，细胞传代通常早约24小时，当细胞融合度达 85% 时进行传代。这种简单的无异种成分培养基可将批次差异降至最低，改善了多能干细胞的无饲养层培养条件。

• Essential 8™ 培养基，由 Essential 8™ 基础培养基和 Essential 8™ 添加剂 (50X) 组成（货号 A1517001）
• 截短型重组人玻连蛋白 (VTN-N)（货号 A14700）或 Geltrex ® 经 hESC 验证的无 LDEV 低生长因子基底膜基质（货号 A1413301）
• 不含钙、镁离子的 Dulbecco's PBS (DPBS)（货号 14190-144）
• Versene 溶液（货号 15040-066）或 UltraPure™ 0.5 M EDTA，pH 8.0（货号 15575-020）
• 含 GlutaMAX™-I 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)（货号 10569-010）
• 二甲基亚砜 (DMSO)（Sigma，货号 D2650）
• 37°C 水浴
• 适当的组织培养板和用品

Essential 8™ 培养基（500 mL 完全培养基）

1. 室温下解冻 Essential 8™ 添加剂 (50X) 约 1 h。请勿在 37°C 下对冷冻的添加剂解冻。
2. 要制备 500 mL Essential 8™ 完全培养基，请在无菌条件下混合下列组分：
   

   组分	用量
   Essential 8™ 基础培养基	490 mL
   Essential 8™ 添加剂 (50X)	10 mL

3. Essential 8™ 完全培养基可在 2–8°C 条件下储存最长2周。
   注：在使用前，请在室温下预热当天所需的完全培养基，直到触感不再冰凉。请勿在 37°C 下预热培养基。

含 0.5 mM EDTA 的 DPBS 溶液 (50 mL)

1. 要制备 50 mL 含 0.5 mM EDTA 的 DPBS 溶液，请在生物安全柜中以无菌条件将以下组分混合于 50 mL 锥形管中：
   

   组分	用量
   不含钙、镁离子的 DPBS	50 mL
   0.5 M EDTA	50 μL

2. 对溶液进行过滤灭菌。溶液可在室温下储存最长6个月。

使用玻连蛋白 (VTN-N) 包被培养容器

1. 接收后，将玻连蛋白样品瓶在室温下解冻并在聚丙烯管中制备 60 μL 玻连蛋白等分试样。将等分试样在–80°C 条件下冷冻或立即使用。
2. 在包被培养容器之前，使用以下公式计算玻连蛋白的工作浓度，并适当稀释储备液。培养表面积和所需用量请参见表1。
   
   玻连蛋白的最佳工作浓度取决于细胞系。我们建议在培养表面采用 0.1–1.0 μg/cm2 的最终包被浓度，具体取决于您的细胞系。对于人 PSC 培养，我们通常使用 0.5 μg/cm2 的玻连蛋白。
   
   
   
   示例：要以 0.5 μg/cm2 的包被浓度包被6孔板，您需要按以下工作浓度制备 6 mL 稀释玻连蛋白溶液（10 cm2/孔表面积，1 mL 稀释玻连蛋白/孔；见表1）：
   
   
3. 要包被6孔板的孔，从 –80°C 储存条件下取出 60 μL 玻连蛋白等分试样，并在室温下解冻。每个6孔板需要一份 60 μL 等分试样。
4. 室温下，将 60 μL 解冻的玻连蛋白加入含 6 mL 无菌 DPBS（不含钙、镁离子）的 15 mL 锥形管中。通过用移液器上下吹吸玻连蛋白稀释液，轻轻重悬。
   注：所得工作浓度为 5 μg/mL（即，1:100 稀释）。
5. 向6孔板的每个孔中分装 1 mL 稀释的玻连蛋白溶液（其他培养容器的推荐用量参见表1）。
   注：当用于以 1 mL/孔包被6孔板（10 cm2/孔）时，最终浓度为 0.5 μg/cm2。
6. 室温孵育1小时。
   注：培养皿可立即使用，也可用实验室薄膜包裹在 2–8°C 下储存最长一周。请勿使容器干燥。使用前，将培养容器预热至室温至少1小时。
7. 从培养容器中吸出稀释的玻连蛋白溶液并弃去。去除玻连蛋白后无需冲洗培养容器。细胞可直接在玻连蛋白包被的培养皿上传代。
   注：Geltrex® 经 hESC 验证的无 LDEV 低生长因子基底膜基质可以代替玻连蛋白（参见附录）。
   
   表1所需的稀释玻连蛋白用量
   

   培养容器	表面积 (cm2)	稀释底物的用量 (mL)
   6孔板	10 cm2/孔	1 mL/孔
   12孔板	4 cm2/孔	0.4 mL/孔
   24孔板	2 cm2/孔	0.2 mL/孔
   35 mm 培养皿	10 cm2	1 mL
   60 mm 培养皿	20 cm2	2 mL
   100 mm 培养皿	60 cm2	6 mL

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何时分传细胞

通常，在出现以下情况之一时，分传细胞：

• PSC 集落太密集或太大。
• PSC 集落分化增强。
• 通常每4天，集落会覆盖约 85% 的培养容器表面积。即使集落稀疏且较小，也应每 4-5 天分传一次培养物。

分传比例

• 分传比例可能有所不同，但对于早期传代通常在 1:2 和 1:4 之间，对于成熟的培养物通常在 1:3 和 1:12 之间。有时，细胞生长速度不同，需要调节分传比例。
• 一般规则是遵循上次分传比例，并根据 PSC 集落的外观调整该比例。如果细胞健康且集落间隔足够，则采用相同的分传比例。如果它们过于密集和拥挤，则提高该比例。如果细胞稀疏，则降低该比例。

使用 Versene 或 EDTA 对 PSC 集落进行传代

注：到第4代，新衍生的 PSC 细胞系可能含有相当数量的分化。无需在传代之前去除分化的材料。通过增殖/分传细胞，整个早期传代的整体培养物健康状况应得到改善。

重要提示：对于在 Essential 8™ 培养基和玻连蛋白上培养的细胞，胶原酶和分散酶等酶的效果不佳。使用这些酶传代细胞导致活力和贴壁能力下降。

1. 开始前，在通风橱中将玻连蛋白包被的培养皿平衡至室温（大约需要1小时）。在室温下预热所需用量的 Essential 8™ 培养基，直到触感不再冰凉。
   注：请勿在 37°C 水浴中预热培养基。
2. 用巴斯德吸管从含 PSC 的容器中吸出用过的培养基，并用不含钙、镁离子的 Dulbecco’s PBS (DPBS) 冲洗容器两次。推荐用量请参见表2。
3. 向含有 PSC 的容器中加入 1X Versene 溶液。根据不同的培养皿尺寸调整 Versene 的用量（请参见表2）。涡旋培养皿以包被整个细胞表面。
   注：含 0.5 mM EDTA 的 DPBS 溶液可替代 Versene 溶液。
4. 将容器在室温下孵育 5–8 分钟或在 37°C 下孵育 4–5 分钟。当细胞开始分离并变圆且在显微镜观察到集落中出现空洞时，即可从容器中取出。
   注：在更大的容器或某些细胞系中，该过程可能需要5分钟以上。
5. 用巴斯德吸管吸出 Versene 溶液。
6. 根据表2向培养皿中添加预热的 Essential 8™ 完全培养基。
   
   表2所需的试剂用量
   

   培养容器	近似表面积 (cm2)	DPBS (mL)	1X Versene 溶液 (mL)	Essential 8™ 完全培养基 (mL)
   6孔板	10 cm2/孔	2 mL/孔	1 mL/孔	2 mL/孔
   12孔板	4 cm2/孔	1 mL/孔	0.4 mL/孔	1 mL/孔
   24孔板	2 cm2/孔	0.5 mL/孔	0.2 mL/孔	0.5 mL/孔
   35 mm 培养皿	10 cm2	2 mL	1 mL	2 mL
   60 mm 培养皿	20 cm2	4 mL	2 mL	4 mL
   100 mm 培养皿	60 cm2	12 mL	6 mL	12 mL

7. 使用 5 mL 玻璃移液器轻轻喷射培养基，将集落吹起，从孔中取出细胞。避免产生气泡。将细胞收集到 15 mL 锥形管中。
   重要提示：请勿从培养皿中刮取细胞。可能有明显的未脱落和遗留的细胞斑块。请勿尝试通过刮取进行回收。
   注：经 Versene 处理后，需要很少或不需要额外移液来破碎细胞团块。只需进行两至三次研磨。请勿用力吸取，否则集落会破碎。
   注：根据细胞系的不同，一次只能处理一到三个孔，向孔中加入 Essential 8™ 培养基后，快速取出细胞。Versene 的初始效应将被培养基迅速中和。一些细胞系在加入培养基后会非常迅速地重新贴壁，必须一次取出1个孔的细胞。另外一些细胞系重新贴壁的速度较慢，一次可以取出3个孔的细胞。
8. 从预包被的培养皿中吸出残留的玻连蛋白溶液。
9. 向包被的6孔板的每个孔中加入适量的预热 Essential 8™ 培养基，使得加入细胞悬液后每个孔中含有 2 mL 培养基。有关其他培养容器的用量，请参见表2。
10. 轻轻翻转几次，混合步骤7得到的细胞悬液，然后按照所需分传比例，转移适量细胞悬液至含预热 Essential 8™ 完全培养基的各孔中。
11. 以划8字的方式快速移动容器数次，将细胞分散于容器表面。
12. 将培养皿轻轻放入 37°C、5% CO₂ 培养箱，并孵育细胞过夜。
13. 分传后第二天为 PSC 补料。每天更换用过的培养基。
    注：传代后观察到细胞碎片和小集落是正常现象。
14. （可选）：要提高细胞存活率，可在传代后24小时内添加 RevitaCell™ 添加剂（货号 A26445）至 1X 最终浓度（即，每 2 mL 细胞悬液添加 20 µL）。

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冷冻 PSC

1. 解冻 PSC 低温培养基（货号 A2644601）并在 2°C 至 8°C 下预冷。
   注：可以使用 Essential 8™ 培养基 + 10% DMSO 代替 PSC 低温培养基进行冷冻保存，但会导致相对性能降低。
2. 根据标准细胞传代方案收获 PSC。
3. 以 200 × g 离心细胞悬液4分钟。
4. 吸出培养基，小心不要扰动细胞沉淀。
5. 向细胞中逐滴加入 PSC 低温培养基（冷却至 2°C 至 8 °C），同时轻轻来回摇动试管，然后轻轻重悬细胞沉淀。
   注：一般而言，从 100 mm 培养皿中，可生成 8–12 个含 1x10⁶ 个活细胞/mL 的样品瓶。
6. 根据生产商规范，将悬液等分试样分装至冻存管内（即，向 2 mL 冻存管内分装 1.5 mL）。
   注：经常搅拌 PSC 低温培养基中的细胞悬液，以保持细胞悬液均匀。如果在细胞收获时使用团块传代方法，则通过轻轻倒置混合细胞悬液，以防止细胞破碎成较小的团块。
7. 按照标准程序，在自动或手动控制速率的冷冻装置中冻存细胞（每分钟降低约 1°C）。
8. 将冷冻细胞样品瓶转移至液氮（气相）中；我们建议在 –200°C 至 –125°C 下储存。

解冻和复苏 PSC

1. 在 37°C 水浴中快速解冻冻存的 PSC，直到只剩下一小块冰晶。
2. 用移液管轻轻上下吹吸解冻的细胞，形成细胞悬液，然后将其转移到 50 mL 锥形管中。
3. 每毫升冻存细胞加入 3 mL 生长培养基，稀释细胞悬液，在轻轻来回摇动试管的同时逐滴加入，避免细胞出现渗透压休克。
4. 以 200 × g 离心细胞悬液4分钟。
5. 吸出培养基，小心不要扰动细胞沉淀。
6. 将细胞轻轻重悬于添加 RevitaCell™ 添加剂的生长培养基中，该添加剂的最终浓度为 1X（即，将 100 μL RevitaCell™ 添加剂加入 10 mL 生长培养基中）。
   注：不要在生长培养基中添加任何额外的 ROCK 抑制剂。
7. 将细胞悬液转移至适当的生长容器中，并在推荐的培养环境中孵育 18–24 小时。
   注：有关推荐的细胞接种密度，请参见下表。
8. 孵育 18–24 小时后，吸出添加 RevitaCell™ 添加剂的生长培养基，并在剩余培养物中替换为不含添加剂的生长培养基（即不添加 RevitaCell™ 添加剂）。

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A. 用 Geltrex® 经 hESC 验证的无 LDEV 基底膜基质包被培养容器

1. 将 5 mL 瓶装 Geltrex® 经 hESC 验证的无 LDEV 低生长因子基底膜基质在 2–8°C 下过夜解冻。
2. 使用无菌冷 DMEM/F-12 按 1:1 比例稀释解冻的 Geltrex® 溶液，在冰上冷却的试管中制备 1 mL 等分试样。这些等分试样可在 –20°C 下冷冻或立即使用。
   注：可根据您的需要调整按 1:1 稀释的 Geltrex® 溶液的分装体积。
3. 要制备工作储备液，在冰上使用冷 DMEM 以 1:50 的比例稀释 Geltrex® 等分试样，总稀释度为 1:100。
   注：可能需要针对每个细胞系确定 Geltrex® 溶液的最佳稀释度。尝试 1:30 至 1:100 的各种稀释度。
4. 使用 Geltrex® 溶液快速覆盖每个培养皿的整个表面（参见表3）。
5. 将培养皿在 37°C、5% CO₂ 培养箱内孵育1小时。
   注：培养皿可立即使用或在 2–8°C 下储存最长一周。请勿使培养皿干燥。
6. 从培养皿中吸出稀释的 Geltrex® 溶液并弃去。去除后无需冲洗培养皿中的 Geltrex® 溶液。现在即可将细胞直接传代至 Geltrex® 基质包被培养皿上。

表3所需的 Geltrex® 经 hESC 验证的基质用量

参考文献

1. Chen G., Gulbranson D.R., Hou Z., Bolin J.M., Ruotti V., Probasco M.D., Smuga-Otto K., Howden S.E., Diol N.R., Propson N.E., Wagner R., Lee G.O., Antosiewicz-Bourget J., Teng J.M., Thomson J.A.(2011) Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.Nat Methods 8(5):424–429.

MAN0007035           版本 B.0

仅供研究使用。不可用于诊断程序。