Culturing Human Embryonic Stem Cells (hESCs) on MEF-Conditioned Medium

介绍

一些应用需要在不存在鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 饲养层的情况下维持人胚胎干细胞 (hESC)。本实验方案描述了在含 MEF 条件培养基 (MEF-CM) 的基质包被培养板上对 hESC 的培养。

在此系统中，hESC 保持高密度。融合时，细胞达 300,000–500,000 个细胞/cm2。

需要的材料

  • Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (D-MEM)（货号 10569-010）
  • 经 ESC 验证的胎牛血清 (FBS)（货号 10439-024）
  • 含 GlutaMAX™-I 的 D-MEM/F-12 (1X)（货号 10565-018）
  • KnockOut™ 血清替代物 (KSR)（货号 10828-028）
  • MEM 非必需氨基酸溶液，10 mM（货号 11140-050）
  • β-巯基乙醇，1000X（货号 21985-023）
  • Gibco 小鼠胚胎成纤维细胞（经辐照）（货号 S1520-100）
  • 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)（货号 PHG0264）
  • GlutaMAX™-I (100X)（货号 35050-079）
  • IV 型胶原酶（货号 17104-019）（用于酶传代）或 StemPro EZPassage™ 工具（货号 23181-010）（用于机械传代）
  • 细胞刮刀（Falcon，货号 353085）
  • 含钙、镁离子的 Dulbecco's PBS (DPBS)（货号 14040-133）
  • 不含钙、镁离子的 Dulbecco's PBS (DPBS)（货号 14190-144）
  • Geltrex 经 hESC 验证的无 LDEV 低生长因子基底膜基质（货号
    A1413301 或 A1413302）或 CELLstart™ CTS™ 底物（货号 A1014201）
  • 附着因子（货号 S006100）
  • 经干细胞测试的 0.22 μm 孔径无菌过滤器（Nalgene，货号 564-0020 或 156-4020）
  • BD Falcon T175 TC 培养瓶（Falcon，货号 353112）
  • 37°C 水浴
  • 适当的组织培养板和用品

注：作为含 GlutaMAX™-I 的 D-MEM/F-12 (1X)、KSR 和 bFGF 的替代物，您可以使用 KnockOut™
ESC/iPSC 培养基试剂盒（货号 A1412901）。

制备培养基与材料

10 μg/mL bFGF 溶液 (1000 μL)

  1. 要制备 1 mL 10 μg/mL bFGF 溶液，请在无菌条件下混合下列组分：
组分用量
bFGF10 μg
不含钙、镁离子的 DPBS980 μL
KSR10 μL

       2.    分装，在 –20°C 条件下最长可储存6个月。

10 mg/mL IV 型胶原酶溶液

  1.  向 IV 型胶原酶中加入 D-MEM/F-12，制成 10 mg/mL 的溶液。轻轻涡旋，使溶液混悬并
    对溶液进行过滤灭菌。可分装此溶液并在 –20°C 条件下冷冻，直至使用。
  2. 如果在 2–8°C 下适当储存（分装储存，以避免重复加热），10 mg/mL 工作溶液可使用2周。

MEF 培养基（用于制备 100 mL 完全培养基）

  1. 要制备 100 mL MEF 完全培养基，请在无菌条件下混合下列组分：

组分用量
D-MEM89 mL
经 ESC 验证的 FBS10 mL
MEM 非必需氨基酸溶液，10 mM1 mL
β-巯基乙醇，1000X100 μL

       2.   MEF 完全培养基可在 2–8°C 条件下储存最长1周。

多能干细胞 (PSC) 培养基（用于制备 100 mL 完全培养基）

  1. 要制备 100 mL PSC 完全培养基，请在无菌条件下混合下列组分：

组分用量
D-MEM/F-1279 mL
KSR20 mL
MEM 非必需氨基酸溶液，10 mM1 mL
bFGF (10 μg/mL)*40 μL
β-巯基乙醇，1000X100 μL
* 在更换培养基时加入 bFGF（最终浓度 4 ng/mL）。

      2.  MEF 完全培养基可在 2–8°C 条件下储存最长4周。

制备 MEF 条件培养基 (MEF-CM)

  1. 用附着因子 (AF) 溶液覆盖各新培养容器的整个表面，并将容器在 37°C 下孵育30分钟或在室温下孵育1小时。要生成 MEF-CM，建议使用 T-175 培养瓶。
  2. 在层流培养罩中采用无菌操作，临用前通过抽吸完全去除培养容器中的 AF 溶液。包被容器可立即使用或在室温下储存不超过24小时。
    注：在加入细胞或培养基之前，无需洗涤培养表面。
  3. 在以 AF 包被并含有 30 mL MEF 培养基的 T-175 培养瓶中，接种 9.4 × 106 个经丝裂霉素 C 处理或经辐照的 MEF
    。
  4. 第二天，将 MEF 培养基更换为 90 mL PSC 培养基。
  5. 在连续7天、每天处理24小时后，从培养瓶中收集 PSC 培养基（现认为是 MEF-CM）。
  6. 每天用 0.22 μM 过滤器对收集的 MEF-CM 进行过滤灭菌。过滤的 MEF-CM 可储存在
    –20°C 下，直至使用。
  7. 使用时，在 37°C 水浴中解冻 MEF-CM，并新鲜补充额外的 bFGF (20 ng/mL)。

用 Geltrex 经 hESC 验证的无 LDEV 基底膜基质包被培养容器

  1. 将 5 mL 瓶装 Geltrex 经 hESC 验证的无 LDEV 低生长因子基底膜基质在 2–8°C 下过夜解冻。
  2. 使用无菌冷 D-MEM/F-12 按 1:1 的比例稀释解冻的 Geltrex 溶液，在冰上冷却的试管中制备 1 mL 等分试样
    。这些等分试样可在 –20°C 下冷冻或立即使用。
    注：可根据您的需要调整按 1:1 稀释的 Geltrex 溶液的分装体积。
  3. 要制备工作储备液，在冰上使用冷 D-MEM 以 1:50 的比例稀释 Geltrex 等分试样，总稀释度为 1:100。
    注：可能需要针对每个细胞系确定 Geltrex 溶液的最佳稀释度。尝试 1:30 至 1:100 的各种稀释度。
  4. 使用 Geltrex 溶液快速覆盖各培养皿的整个表面（参见表1）。
  5. 将培养皿在 37°C、5% CO2 培养箱内孵育1小时。
    注：培养皿可立即使用或在 2–8°C 下储存最长一周。请勿使培养皿干燥。
  6. 从培养皿中吸出稀释的 Geltrex 溶液并弃去。去除后无需冲洗
    培养皿中的 Geltrex 溶液。现在即可将细胞直接传代至 Geltrex 基质包被培养皿上的 MEF-CM 中。
    注：CELLstart™ CTS™ 底物可以替换为 Geltrex 经 hESC 验证的基质（请参见附录）。

表1. 所需的 Geltrex 经 hESC 验证的基质用量

培养容器 表面积 (cm2) 稀释底物的用量 (mL)
6孔板10 cm2/孔1.5 mL/孔

12孔板		4 cm2/孔750 μL/孔
24孔板2 cm2/孔350 μL/孔
35 mm 培养皿10 cm21.5 mL
60 mm 培养皿20 cm23.0 mL
100 mm 培养皿60 cm26.0 mL

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hESC 解冻和铺板

  1. 在 Geltrex 基质包被培养皿上标记样品瓶的传代次数、日期和用户姓名首字母。
  2. 使用金属镊子从液氮储存设备中取出 hESC 样品瓶。
    注：如果样品瓶从取出至解冻暴露于环境温度超过15秒，则将样品瓶转移至含有少量液氮的容器中。
  3. 戴手套滚动样品瓶，直至外部无霜。该过程需要约 10–15 秒。
  4. 将样品瓶浸入 37°C 水浴中，不要浸没瓶盖。轻轻涡旋样品瓶。
  5. 当仅剩余一块冰晶时，从水浴中取出样品瓶，用 70% 乙醇喷洒样品瓶外部
    进行灭菌，并将其置于通风橱中。
  6. 使用 5 mL 无菌移液器，将解冻的细胞轻轻移至 50 mL 无菌锥形管中。
  7. 向 50 mL 锥形管内的细胞中缓慢逐滴加入 10 mL MEF-CM。添加培养基时，
    来回轻轻晃动锥形管以混匀 hESC。这可减少细胞的渗透压休克。
  8. 用 1 mL MEF-CM 冲洗样品瓶，然后加至含有细胞的 50 mL 锥形管中。
  9. 将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中。以 200 × g 离心细胞5分钟。
  10. 吸出上清液并弃去。
  11. 根据表2，通过用移液器在离心管中轻轻上下吹吸细胞数次，将细胞沉淀重悬于足量的 MEF-CM 中。
  12. 从制备的培养皿中吸出过量的 Geltrex 溶液，并将解冻的集落缓慢加入培养皿中。前后左右快速短距离移动培养皿数次，使细胞分散在培养皿表面。
  13. 将培养皿轻轻放入 37°C、5% CO2 培养箱，并孵育细胞过夜。
  14. 第二天，使用无菌血清移液管去除用过的培养基及碎片，并将其转移至制备的 Geltrex 基质包被培养皿中。如果主培养皿有问题，您可以使用此培养皿作为备份。
  15. 根据表2中的用量向每个培养皿中加入新鲜的 MEF-CM。将两块培养板轻轻放入 37°C、5% CO2 培养箱中过夜。
  16. 在显微镜下检查细胞，并每天更换两块培养板中用过的培养基。如果对超过一块培养板加料，则为每个孔使用不同的移液器，以降低污染风险。在一周内可能无法观察到集落。

表2.所需的 MEF-CM 用量

培养容器 表面积 (cm2) 用量 (mL)
6孔板10 cm2/孔2.0 mL/孔
12孔板4 cm2/孔1.0 mL/孔
24孔板2 cm2/孔0.5 mL/孔
35 mm 培养皿10 cm22.0 mL
60 mm 培养皿20 cm24.0 mL
100 mm 培养皿60 cm210.0 mL

图1. 在 Geltrex 基质包被培养皿上的 MEF-CM 中培养的 hESC

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hESC 传代

何时分传细胞

通常，在出现以下情况之一时，分传细胞：

  • hESC 集落太密集或太大。
  • 分化增强。

分传比例

  • 分传比例可能有所不同，但通常在 1:2 和 1:4 之间。有时，细胞生长速度不同，需要调节分传比例。一般规则是遵循上次分传比例，并根据 hESC 集落的外观调整该比例。
  • 如果细胞健康且集落间隔足够，则采用相同的分传比例。如果它们过于密集和拥挤，则提高该比例。如果细胞稀疏，则降低该比例。根据外观，细胞需要每 4-10 天分传一次。

图2.可供传代的 hESC 集落。注意集落较大且集落彼此非常靠近。

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使用胶原酶进行酶传代

您可以通过下述酶法或接下来的章节中介绍的机械方法传代细胞
。

  1. 在新的 Geltrex 基质包被培养皿上标记细胞系名称、新的传代次数、日期、分传比例和用户姓名首字母。将培养皿放回培养箱中。
  2. 在解剖显微镜下，从待传代的培养皿中取出分化的集落。
  3. 用巴斯德吸管从培养皿中吸出用过的培养基，并用不含钙、镁离子的 Dulbecco’s PBS (DPBS) 冲洗培养皿一次。
  4. 向含有 hESC 的培养皿中加入 IV 型胶原酶 (10 mg/mL) 溶液。根据
    不同的培养皿尺寸调整 IV 型胶原酶的用量（例如，35 mm 培养皿需要 1 mL IV 型胶原酶）。
  5. 将培养皿在 37°C、5% CO2 培养箱中孵育 5–7 分钟。请注意，不同批次的胶原酶的孵育时间可能有所不同；因此，需要检查集落以确定适当的孵育时间。
    注：作为 IV 型胶原酶的替代物，您可以使用浓度为 2 mg/mL 的分散酶，并在 37° C、5% CO2 培养箱中孵育培养皿 2–3 分钟。
  6. 集落边缘开始脱离培养板时停止孵育（见图3）。

    图3.使用 IV 型胶原酶处理后，PSC 集落脱离 Geltrex 基质层

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  7. 用巴斯德吸管吸出 IV 型胶原酶溶液。在不扰动附着细胞层的情况下，小心去除胶原酶。
  8. 向每个培养皿中加入 MEF-CM。使用 5 mL 移液器上下吹吸，将细胞轻轻吹离培养皿表面
    。确保轻轻吹吸，以尽量减少气泡的形成。
  9. 将 hESC 从孔表面取出后，将孔内容物合并至 15 mL 锥形管中。
  10. 使用 5 mL 移液器，向培养皿中加入 MEF-CM，洗涤并收集任何残留细胞。吸出培养基和细胞，然后将收集的细胞加入 15 mL 锥形管中。
  11. 在 15 mL 锥形管中轻轻上下吹吸细胞数次，以进一步打散细胞集落。用移液管
    小心移取以减少泡沫。
    注：避免制备单细胞悬液。
  12. 以 200 × g 离心5分钟，然后从 hESC 沉淀上吸出上清液。
  13. 用适量 MEF-CM 重悬沉淀（请参见表2）。这取决于分传比例和所用培养皿的数量。
  14. 用 10 mL 移液器混匀细胞悬液。注意不要使集落过度破碎或在培养基中产生气泡。
  15. 向每个培养皿中加入适量细胞悬液。将培养皿放回培养箱中。
  16. 前后左右快速短距离移动培养皿数次，使细胞分散在培养皿表面。
  17. 过夜孵育细胞，使集落贴壁。每天更换用过的培养基。
    注：当细胞贴壁培养时，打开和关闭培养箱门时应小心，避免影响细胞在孔表面的均匀分布。

使用 StemPro EZPassage™ 一次性细胞传代工具进行机械传代

  1. 将含细胞的培养皿中的培养基更换为新鲜的 MEF-CM。
  2. 在层流罩下打开装有 EZPassage™ 工具的包装，取出工具。
  3. 一只手握住培养容器，沿一个方向拉动（滚动）EZPassage™ 工具穿过整个培养皿。施加轻柔但稳定的压力，使整个滚轮接触培养皿，并在滚动过程中保持均匀的压力。
  4. 保持 EZPassage™ 工具平行于第1次运动轨迹滚动，直至覆盖整个培养皿。
  5. 旋转培养皿 90°，然后按上述步骤重复滚动细胞层。
  6. 完成后，请丢弃 EZPassage™ 工具，不要重复使用。如有必要，使用细胞刮刀将细胞团从培养板上刮下。
  7. 使用血清移液器，用培养基冲洗培养皿，使切割的集落悬浮在培养基中。
  8. 将含有集落的培养基转移到 15 mL 无菌管中。
  9. 将细胞集落以适当密度接种在已用有丝分裂失活 MEF 铺板的培养皿上。
  10. 将培养板放入 37°C、5% CO2 培养箱中。轻轻振摇培养板，使细胞均匀分布。

图4.使用 StemPro EZPassage™ 一次性细胞传代工具切割后的 PSC 集落

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附录

  • 在 PSC 培养基中，含 GlutaMAX™-I 的 DMEM/F12（货号 10565-018）可替换为以下替代物：

    • KnockOut™ DMEM/F-12（货号 12660-012）

      如需使用 KnockOut™ DMEM/F-12 制备 100 mL PSC 完全培养基，请在无菌条件下混合下表中列出的组分

      组分 储备液
      浓度       		最终
      浓度       		用量
      KnockOut™ DMEM/F-12（货号 12660-012）

      —

      		1X78 mL
      KnockOut™ SR（货号 10828-028）

      —

      		20%20 mL
      GlutaMAX™-I（货号 35050-061）200 mM2 mM1 mL
      MEM 非必需氨基酸溶液
      （货号 11140-050）      		10 mM0.1 mM1 mL
      bFGF（货号 PHG0024）10 μg/mL4 ng/mL40 μL
      β-巯基乙醇（货号 21985-023）1000X1X100 μL

    • KnockOut™ DMEM（货号 10829-018）

      如需使用 KnockOut™ DMEM 制备 100 mL PSC 完全培养基，请在无菌条件下混合下表中列出的组分。

      组分 储备液
      浓度       		最终
      浓度       		用量
      KnockOut™ DMEM（货号 10829-018）

      —

      		1X78 mL
      KnockOut™ SR（货号 10828-028）

      —

      		20%20 mL
      GlutaMAX™-I（货号 35050-061）200 mM2 mM1 mL
      MEM 非必需氨基酸溶液
      （货号 11140-050）      		10 mM0.1 mM1 mL
      bFGF（货号 PHG0024）10 μg/mL4 ng/mL40 μL
      β-巯基乙醇（货号 21985-023）1000X1X100 μL

  • 替代物 bFGF 包装规格

产品名称 货号 产品规格
重组人碱性 FGF (AA 1-155)PHG026410 μg
重组人碱性 FGF (AA 1-155)PHG026625 μg
重组人碱性 FGF (AA 1-155)PHG0261100 μg
重组人碱性 FGF (AA 1-155)PHG02631 mg

  • 用于收获 iPSC 的解离酶/工具

解离酶/工具 应用 建议浓度
StemPro EZPassage™ 工具
（货号 23181-010）		手动传代一次性无菌工具
StemPro Accutase
（货号 A11105-01）		传代后形成单层细胞、
解离成单细胞		1X 即用型
（在 37°C 下孵育 1–2 分钟）
分散酶（货号 17105-041）传代后形成集落样形态2 mg/mL
（在 37°C 下孵育 2–3 分钟）
TrypLE™ Express
（货号 12604-021）		解离成单细胞1X 即用型

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仅供研究使用。不得用于人或动物的任何治疗或诊断用途。

MAN0006682          2012年3月5日

仅供科研使用，不可用于诊断目的。