使用 CytoTune-iPS 2.0 仙台病毒重编程试剂盒在无饲养层条件下重编程外周血单核细胞 (PBMC)

• CytoTune-iPS 2.0 仙台病毒重编程试剂盒（货号A16517 和 A16518）
  注：为确保成功进行重编程，您需要全部三种重编程载体。
  
• 要重编程的外周血单核细胞 (PBMC)
  注：可使用通过传统方法（例如 Ficoll-Paque® 纯化）提取的 PBMC 或冷冻 PBMC。
• StemPro-34 SFM 培养基^[1]（货号 10639-011）
• L-谷氨酰胺（货号 25030-081）
• 重组人 SCF（c-kit 配体）（货号 PHC2111）
• 重组人 FLT-3 配体（货号 PHC9414）
• 重组人 IL-3（货号 PHC0034）
• 重组人 IL-6（货号 PHC0065）
• 截短型重组人玻连蛋白 (VTN-N)（货号 A14700）
• Geltrex 经 hESC 验证的无 LDEV 低生长因子基底膜基质（货号 A1413301）（可选）
• 不含钙、镁离子的 DPBS（货号 14190-144）
• 配备体视显微镜的无菌细胞培养通风橱（即生物安全柜）
• 倒置显微镜
• 设置为 37°C、5% CO₂ 的培养箱
• 设置为 37°C 的水浴
• 无菌血清移液器（5 mL、10 mL）
• 离心机（旋转吊篮转头）
• 15 mL 离心管
• 无菌圆底离心管（例如 Falcon 352054）
• 6孔、12孔和24孔经组织培养处理的培养板
• 25号 1½ 英寸针头

^[1] StemPro-34 SFM 培养基：适用于人离体组织和细胞培养处理应用。注意：作为医疗产品使用时，美国联邦法规规定仅可由医生出售或凭其处方出售。

• 为保持无菌培养条件，所有步骤均采用无菌实验室规范在层流罩下进行。
• 为确保成功进行重编程，使用全部三种重编程载体转导您的细胞。
  注：为确保成功进行重编程，需要在您的宿主细胞中表达全部四种山中因子（即，Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc）。
• 各 CytoTune-iPS 2.0 仙台病毒重编程载体的滴度因批次而异。对于您的载体的具体滴度，请参考我们网站上提供的分析证书 (CoA)。请访问 www.lifetechnologies.com/cytotune 并通过产品批号（印在样品瓶上）搜索 CoA。
• 病毒滴度会随着每次冻融循环而显著降低。请避免对重编程载体进行反复冻融。重新冷冻和解冻的试剂盒无法保证病毒滴度。
• 在开始之前，确保培养基已平衡至 37°C，并进行适当的气体平衡。
• 对于阳性对照，我们建议使用人新生儿包皮成纤维细胞（BJ 株；ATCC 编号 CRL2522）进行重编程实验。请注意，不同靶细胞的实验条件可能不同，需要针对每种细胞类型进行优化。以下实验方案中给出的示例不能保证所有细胞类型均能产生 iPSC。

SCF（c-kit 配体）、FLT-3 配体、IL-3 和 IL-6 储备液

SCF（c-kit 配体）、FLT-3 配体、IL-3 和 IL-6 均以冻干形式提供。按照特定产品说明书中的说明制备储备液，并分装成等分试样冷冻储存。使用时进行解冻。

PBMC 培养基（用于制备 500 mL 完全培养基）

PBMC 培养基由添加适当细胞因子的 StemPro-34 完全培养基组成。按以下步骤制备 500 mL PBMC 完全培养基。

1. 将冷冻的 StemPro-34 营养添加剂在 4°C 下过夜解冻。
2. 解冻后，轻轻翻转样品瓶数次，充分混匀添加剂，然后在无菌条件下将样品瓶的全部内容物转移至 StemPro-34 SFM 瓶中。涡旋该瓶以混合并获得均匀的完全培养基。
3. 在无菌条件下加入 L-谷氨酰胺至最终浓度 2 mM（将 5 mL 200 mM L-谷氨酰胺加至 500 mL 培养基中）。
4. 完全培养基（无细胞因子）在 2–8°C 条件下避光保存时的有效期为30天。
5. 在使用当天添加以下细胞因子至指定的最终浓度：

Essential 8 培养基（用于制备 500 mL 完全培养基）

1. 在使用前将冷冻的 Essential 8 添加剂在 2-8°C 条件下过夜解冻，用于配制完全培养基。请勿在 37°C 下对冷冻的添加剂解冻。
2. 通过轻轻倒置样品瓶数次混合解冻的添加剂，从 Essential 8 基础培养基瓶中取出10 mL，然后在无菌条件下将 Essential 8 添加剂的全部内容物转移至 Essential 8 基础培养基瓶中。涡旋该瓶以混合并获得 500 mL 均匀的完全培养基。
3. Essential 8 完全培养基可在 2-8°C 条件下储存最长2周。在使用前，请在室温下预热当天所需的完全培养基，直到触感不再冰凉。请勿在 37°C 下预热培养基。

以下实验方案已针对通过 Ficoll-Paque® 密度梯度离心分离并冷冻在含 FBS 和 DMSO 的培养基中的外周血单核细胞 (PBMC) 进行了优化。我们建议您针对您的细胞类型优化实验方案。

第 -4 天：接种 PBMC

1. 转导前4天，解冻 PBMC 并将细胞轻轻转移至 15 mL 锥形管中。缓慢（逐滴）向细胞悬液中加入 5–10 mL 预热的 PBMC 完全培养基（含适当细胞因子的 StemPro-34 无血清完全培养基；分装细胞因子并每天新鲜加入）。取出一份细胞等分试样进行计数并测定细胞活力。
2. 将细胞悬液以 200 × g 离心10分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于 PBMC 完全培养基中，使浓度达到500,000个细胞/mL。
3. 在24孔板的中间部分每孔加入 1 mL，以防止孵育过程中培养基过度蒸发。
4. 将细胞在 37°C、含 5% CO₂ 潮湿空气的培养箱中孵育。



   第 -3 天至第 -1 天：观察细胞并加入新鲜培养基



5. 每日进行细胞计数，轻轻去除 0.5 mL 培养基，加入 0.5 mL 新鲜的 PBMC 完全培养基，不要扰动细胞。如果在去除的这 0.5 mL 培养基中含有细胞，则以 200 × g 离心细胞悬液10分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于 0.5 mL 新鲜培养基中。 注：通常会在解冻后第一天观察到一些细胞死亡。一些细胞可能贴壁于组织培养板的表面。继续处理悬液中的细胞。细胞不会发生增殖，但应在第一天之后维持稳定的细胞数量。



   第0天：进行细胞计数并进行转导



6. 使用血细胞计数器或 Countess 自动细胞计数仪进行细胞计数，以确定细胞活力和总数量。
   注：细胞数量可能减少。使用活细胞计数继续进行转导。
7. 收获细胞，使浓度达到 2.5 × 10⁵–5 × 10⁵ 个细胞/mL，以进行转导。我们通常建议每份样品转导300,000个细胞。将适量待转导细胞添加到无菌圆底离心管中。
8. 从 –80°C 的储存设备中取出一组 CytoTune-iPS 2.0 仙台病毒重编程试管。首先将试管底部浸入 37°C 水浴中 5–10 秒钟，然后将试管从水浴中取出，让其在室温下解冻，每次解冻一支试管。解冻后快速离心试管并立即将其置于冰上。
9. 加入 MOI 为5的 Klf4、Oct4 和 Sox2 (KOS) 病毒和 c-Myc 病毒（KOS MOI=5、hc-Myc MOI=5）和 MOI 为3的 Klf4 病毒 (hKlf4 MOI=3)，总体积为1 mL，以此进行细胞转导。此时，通过离心步骤，可大大提高转导和重编程的效率。盖好离心管盖，并用 Parafilm 封口膜包裹。在室温下以 2250 rpm 离心30分钟。离心完成后，将沉淀重悬于含病毒的同一培养基中，再向孔中加入 1 mL PBMC 完全培养基，铺于12孔组织培养板中，并在 37°C 下孵育过夜。注：我们建议最初使用上述 MOI 5、5和3进行转导。可针对您的应用优化该 MOI。
   
   

      第1天：去除 CytoTune 仙台病毒并培养细胞

   
   
10. 第二天，从培养板中取出细胞和培养基，然后转移至 15 mL 离心管中。用 1 mL 培养基轻轻冲洗孔，确保收获大部分细胞。
11. 将 CytoTune 仙台病毒以 200 × g 离心10分钟，吸出上清液，并将细胞在24孔板中重悬于 0.5 mL PBMC 完全培养基中。
    注：细胞可能会大幅死亡 (>60%)；使用活细胞计数继续实验方案。在最初的48小时，在显微镜下观察细胞，如果形态发生变化，则表明发生了有效转导。预期会出现大的聚集细胞。
12. 将细胞在 37°C 培养2天。
    注：孵育细胞时，针对每个含转导细胞的孔，在经 Geltrex 基质或玻连蛋白包被的6孔板中准备两个孔。在 Geltrex 基质包被培养板上观察到较高的重编程效率，但按照该方案，我们在玻连蛋白包被培养板上获得了 0.8% 的重编程效率。请参见在接近本实验方案末尾处提供的使用玻连蛋白包被培养容器和使用 Geltrex 基质包被培养容器的说明。
    
    

       第3天：在玻连蛋白或 Geltrex 基质包被培养皿上进行细胞铺板

    
    
13. 使用所需方法（例如，Countess 自动细胞计数仪）进行细胞计数，并以每皿10,000和50,000个活细胞将细胞接种于 Geltrex 基质或玻连蛋白包被的培养皿，每皿加入 2 mL 不含细胞因子的 StemPro-34 完全培养基。在 37°C 下孵育细胞。将任何过量细胞铺于 Geltrex 基质或玻连蛋白包被的培养皿上，或根据需要收获用于后续 RNA 分析。
    
    

       第 3–6 天：更换用过的培养基

    
    
14. 每隔一天，从细胞中轻轻取出 1 mL（一半）用过的培养基，替换为 1 mL 不含细胞因子的新鲜 StemPro-34 完全培养基，操作过程中需小心，不要扰动细胞。
    
    

       第7天：开始过渡至 Essential 8 培养基

    
    
15. 按照上述步骤制备 500 mL Essential 8 培养基。
16. 从细胞中取出 1 mL（一半）StemPro-34 培养基，替换为 1 mL Essential 8 培养基，开始将细胞过渡到新培养基。
    
    

      第8天至第28天：补料并监测细胞

    
    
17. 24小时后（第8天），将全部培养基更换为 Essential 8 培养基，此后每天更换用过的培养基。
18. 从第8天起，每隔一天在显微镜下观察培养板是否出现提示转化细胞的细胞团块。
19. 转导后第 15-21 天，集落应该已经生长到适于转移的大小。手动挑取集落，并将其转移到制备的12或24孔玻连蛋白或 Geltrex 基质包被的培养板上。

下面提供了用玻连蛋白以 0.5 μg/cm² 的包被浓度包被6孔培养板的说明。

1. 接收后，将玻连蛋白样品瓶在室温下解冻并在聚丙烯管中制备 60 μL 玻连蛋白等分试样。将等分试样在–80°C 条件下冷冻或立即使用。
2. 要包被6孔板的孔，从 –80°C 储存条件下取出 60 μL 玻连蛋白等分试样，并在室温下解冻。每个6孔板需要一份 60 μL 等分试样。
3. 室温下，将 60 μL 解冻的玻连蛋白加入含 6 mL 无菌 DPBS（货号 14190；不含钙、镁离子）的 15 mL 锥形管中。通过用移液器上下吹吸玻连蛋白稀释液，轻轻重悬。
   注：所得工作浓度为 5 μg/mL（即，1:100 稀释）。
4. 向6孔板的每个孔中加入 1 mL 稀释的玻连蛋白溶液（其他培养容器的推荐用量参见下表）。当用于以 1 mL/孔包被6孔板（10 cm²/孔）时，最终浓度为 0.5 μg/cm²。
5. 将包被培养板在室温下孵育1小时。
   注：培养容器可立即使用，也可用实验室薄膜包裹在 2–8°C 下储存最长一周。请勿使容器干燥。使用前，将培养容器预热至室温至少1小时。
6. 吸出玻连蛋白溶液并弃去。去除玻连蛋白后无需冲洗培养容器。可将细胞直接铺于玻连蛋白包被的培养容器上。
   
   

1. 将 5 mL 瓶装 Geltrex 经 hESC 验证的无 LDEV 低生长因子基底膜基质在 2–8°C 下过夜解冻。
2. 要制备工作储备液，在冰上使用冷 DMEM 以 1:50 的比例稀释 Geltrex 基质等分试样。
   注：可能需要针对每个细胞系确定 Geltrex 基质溶液的最佳稀释度。尝试 1:30 至 1:100 的各种稀释度。
3. 使用 Geltrex 基质溶液快速覆盖每个培养皿的整个表面（参见下表）。
4. 将培养皿在 37°C、5% CO₂ 培养箱内孵育1小时。
5. Geltrex 基质包被培养皿可立即使用或在 2–8°C 下储存最长一周。请勿使培养皿干燥。
6. 从培养皿中吸出稀释的 Geltrex 基质溶液并弃去。去除后无需冲洗培养皿中的 Geltrex 基质溶液。现在即可将细胞直接铺于 Geltrex 基质包被培养皿上。