Human Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs)

介绍

诱导多能干细胞 (iPSC) 是一种基因重编程的成体细胞，表现出与胚胎干细胞相似的多能干细胞样状态。1 虽然这些人工生成的细胞在人体中并不存在，但它们表现出与胚胎干细胞 (ESC) 非常相似的特性；因此，iPSC 是药物发现、细胞治疗和基础研究的宝贵资源。

生成 iPSC 的方法有很多种，包括逆转录酶病毒介导的基因转导和化学诱导。逆转录病毒载体需要整合到宿主染色体中才能表达重编程基因，而基于 DNA 的载体和质粒载体以游离形式存在，不需要整合。Episomal iPSC 重编程载体是三种载体的优化混合物，无需整合即可将体细胞重编程为 iPSC。这三种游离型载体具有 oriP/EBNA-1（EB 核抗原 -1）骨架，可递送重编程基因 Oct4、Sox2、Nanog、Lin28、L-Myc、Klf4 和 SV40LT。采用该系统已成功实现了成纤维细胞、CD34+ 细胞和外周血单核细胞 (PBMC) 的重编程。oriP/EBNA-1 介导的核导入和载体 DNA 的保留可以实现高转染效率，可在单次转染中实现 iPSC 衍生。2此外，驱动 EBNA-1 表达的病毒启动子的沉默和由于载体合成和分配缺陷导致的每个细胞周期约 5% 的游离体丢失，使得无需任何额外操作即可从 iPSC 中去除游离型载体。3

要采用 Episomal iPSC 重编程载体获得最佳重编程效率，必须在不含添加剂的成纤维细胞培养基中培养细胞，直到转染当天。转染后，将细胞置于含添加剂的成纤维细胞培养基中过夜复苏，然后转移至添加 bFGF 和由 PD0325901（MEK 抑制剂）、CHIR99021（GSK3β 抑制剂）、A-83-01（TGF-β/激活素/Nodal 受体抑制剂）、HA-100（ROCk 抑制剂）和 hLIF（人白血病抑制因子）组成的小分子混合物的 N2B27 培养基中。培养15天后，将 iPSC 转移至 Essential 8™ 培养基中，该培养基是一种无血清、无异种成分的培养基，可将变异性降至最低，同时改善 iPSC 的无饲养层培养条件。

需要的材料

  • Episomal iPSC 重编程载体（50 μL，1 μg/μL）（货号 A14703）
  • 含 GlutaMAX™-I 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)（高糖）（货号 10569-010）
  • KnockOut™ DMEM/F-12（货号 12660-012）
  • 经 ESC 验证的胎牛血清 (FBS)，美国来源（货号 16141-079）
  • MEM 非必需氨基酸溶液，10 mM（货号 11140-050）
  • 碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)（货号 PHG0264）
  • HA-100（ROCk 抑制剂）（Santa Cruz，货号 sc-203072）
  • 牛白蛋白组分 V 溶液 (BSA)（货号 15260-037）
  • Essential 8™ 培养基，由 Essential 8™ 基础培养基和 Essential 8™ 添加剂 (50X) 组成（货号 A1517001）
  • 含 HEPES 的 DMEM/F-12（货号 11330-057）
  • N-2 添加剂 (100X)（货号 17502-048）
  • B-27 添加剂 (50X)（货号 17504-044）
  • GlutaMAX™-I (100X)（货号 35050-061）
  • β-巯基乙醇，1000X（货号 21985-023）
  • PD0325901（MEK 抑制剂）（Stemgent，货号 04-0006）
  • CHIR99021（GSK3β 抑制剂）（Stemgent，货号 04-0004）
  • A-83-01（TGF-β/激活素/Nodal 受体抑制剂）（Stemgent，货号 04-0014）
  • hLIF（人白血病抑制因子）（货号 PHC9481）
  • 截短型重组人玻连蛋白 (VTN-N)（货号 A14700）或 Geltrex 经 hESC 验证的无 LDEV 低生长因子基底膜基质（货号 A1413301）
  • 0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1X)，酚红（货号 25300-054）
  • UltraPure™ 0.5 M EDTA，pH 8.0（货号 15575-020）
  • 不含钙、镁离子的 Dulbecco's PBS (DPBS)（货号 14190-144）
  • 表征试剂（表面标志物染色）：
    小鼠一抗（需要一种）：
    • 小鼠抗 Tra1-60 抗体（货号 41-1000）
    • 小鼠抗 Tra1-81 抗体（货号 41-1100）
    • 小鼠抗 SSEA4 抗体（货号 41-4000）
      Alexa Fluor 二抗（需要一种）：
    • Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 抗体（货号 A11029）
    • Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 抗体（货号 A11032）
    • Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 抗体（货号 A11034）
    • Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体（货号 A11037）
  • 检测试剂（用于通过 PCR 检测游离型载体）
    • CellsDirect 重悬和裂解缓冲液（货号 11739-010）
    • AccuPrime Taq 高保真（货号 12346-094）
    • PCR 正向和反向引物（PCR 实验方案中提供引物序列）
  • 电穿孔仪（如 Neon 转染系统，货号 MPK5000）
  • 37°C 水浴
  • 适当的组织培养板和用品

工作流程

使用 Episomal iPSC 重编程载体的典型重编程时间表如下所示：

第 -4 天至第 -2 天：      将人成纤维细胞铺于含成纤维细胞培养基的 T75 培养瓶中，使其在转染当天（第0天）达到 75–90% 融合度。
第0天： 

使用 Neon 转染系统转染细胞。将转染细胞铺于玻连蛋白包被的培养皿上，并在含添加剂的成纤维细胞培养基中孵育过夜。

第1天至第14天： 

将培养基更换为添加 CHALP 分子混合物和 bFGF 的 N2B27 培养基；每隔一天更换一次用过的培养基。

第15天： 

将培养基更换为 Essential 8™ 培养基，并监测培养容器中是否出现 iPSC 集落。

第21天： 

挑取未分化的 iPSC 转移到新鲜的玻连蛋白包被的培养皿上进行扩增。

制备培养基与材料

10 μg/mL bFGF 溶液 (1000 μL)

  1. 要制备 1 mL 10 μg/mL bFGF 溶液，请在无菌条件下混合下列组分：

    组分用量
    bFGF10 μg
    不含钙、镁离子的 DPBS980 μL
    BSA10 μL
  2. 分装，在 –20°C 条件下最长可储存6个月。

成纤维细胞培养基（用于制备 100 mL 完全培养基）

  1. 要制备 100 mL 成纤维细胞培养基，请在无菌条件下混合下列组分：

    组分用量
    DMEM89 mL
    经 ESC 验证的 FBS10 mL
    MEM 非必需氨基酸溶液，10 mM1 mL
  2.  成纤维细胞培养基可在 2–8°C 条件下储存最长2周。

含添加剂的成纤维细胞培养基（用于制备 100 mL 完全培养基）

注：每次转染需要 30 mL 含添加剂的成纤维细胞培养基。

  1. 要制备 100 mL 含添加剂的成纤维细胞培养基，临用前将以下组分新鲜加入成纤维细胞培养基中：
    HA-100（ROCk 抑制剂）各异（最终浓度 = 10 μgM）
    bFGF (10 μg/mL) 40 μL（最终浓度 = 4 ng/mL）
  2. 向含添加剂的成纤维细胞培养基中加入 HA-100 和 bFGF 后，必须立即使用。

Essential 8™ 培养基（500 mL 完全培养基）

  1. 在 2–8°C 下过夜解冻 Essential 8™ 添加剂 (50X)。请勿在 37°C 下解冻培养基。
  2. 要制备 500 mL Essential 8™ 完全培养基，请在无菌条件下混合下列组分：
    Essential 8™ 基础培养基 490 mL
    Essential 8™ 添加剂 (50X) 10 mL
  3. Essential 8™ 完全培养基可在 2–8°C 条件下储存最长2周。
    注：在使用前，请在室温下预热当天所需的完全培养基，直到触感不再冰凉。请勿在 37°C 下预热培养基。

N2B27 培养基（250 mL 完全培养基）

  1. 要制备 250 mL N2B27 培养基，请在无菌条件下混合下列组分：
    组分用量
    含 HEPES 的 DMEM/F-12238.75 mL
    N-2 添加剂 (100X)2.5 mL
    B-27 添加剂 (50X)5.0 mL
    MEM 非必需氨基酸溶液，10 mM2.5 mL
    GlutaMAX™-I (100X)1.25 mL
    β-巯基乙醇，1000X

    454.5 μL

  2. 要向 N2B27 培养基中添加 CHALP 分子混合物和 bFGF，请添加以下组分至指定浓度。必须在临用前，新鲜加入这些组分。

    组分用量
    PD0325901（MEK 抑制剂） 0.5 μM
    CHIR99021（GSK3â 抑制剂）3 μM
    A-83-01（TGF-β/激活素/Nodal 受体抑制剂）0.5 μM
    hLIF（人白血病抑制因子）10 ng/mL
    HA-100（ROCk 抑制剂）10 μM
    bFGF (10 μg/mL)

    100 ng/mL


     注：CHALP 分子混合物是经过优化的小分子（CHIR99021、HA-100、A-83-01、hLIF、PD0325901）混合物，可显著提高游离型载体的重编程效率。
  3. N2B27 培养基（不含 CHALP 分子和 bFGF）可在 2–8°C 条件下储存最长1周。

含 0.5 mM EDTA 的 DPBS 溶液 (50 mL)

  1. 要制备 50 mL 含 0.5 mM EDTA 的 DPBS 溶液，请在生物安全柜中以无菌条件将以下组分混合于 50 mL 锥形管中：
    不含钙、镁离子的 DPBS 50 mL
    0.5 M EDTA 50 μL
  2. 对溶液进行过滤灭菌。溶液可在室温下储存最长6个月。

使用玻连蛋白 (VTN-N) 包被培养容器

  1. 从 –80°C 储存条件下取出 1 mL 瓶装玻连蛋白，并在 2–8°C 下解冻过夜。
  2. 将 60 μL 玻连蛋白分配至聚丙烯管中，制备工作等分试样。工作等分试样可在 -80°C 下冷冻或立即使用。
  3. 在包被培养容器之前，使用以下公式计算玻连蛋白的工作浓度，并适当稀释储备液。培养表面积和所需用量请参见表1。
    玻连蛋白的最佳工作浓度取决于细胞系。我们建议在培养表面采用 0.1–1.0 μg/cm2 的最终包被浓度，具体取决于您的细胞系。对于人 PSC 培养，我们通常使用 0.5 μg/cm2 的玻连蛋白。

    示例：要以 0.5 μg/cm2 的包被浓度包被6孔板，您需要按以下工作浓度制备 6 mL 稀释玻连蛋白溶液（10 cm2/孔表面积，1 mL 稀释玻连蛋白/孔；见表1）：
  4. 要包被6孔板的孔，从 –80°C 储存条件下取出 60 μL 等份玻连蛋白，并在室温下解冻。每个6孔板需要一份 60 μL 等分试样。
  5. 室温下，将 60 μL 解冻的玻连蛋白加入含 6 mL 无菌 DPBS（不含钙、镁离子）的 15 mL 锥形管中。通过用移液器上下吹吸玻连蛋白稀释液，轻轻重悬。
    注：所得工作浓度为 5 μg/mL（即，1:100 稀释）。
  6. 向6孔板的每个孔中分装 1 mL 稀释的玻连蛋白溶液（其他培养容器的推荐用量参见表1）。
    注：当用于以 1 mL/孔包被6孔板（10 cm2/孔）时，最终浓度为 0.5 μg/cm2。
  7. 室温孵育1小时。
    注：培养皿可立即使用，也可用实验室薄膜包裹在 2–8°C 下储存最长一周。请勿使容器干燥。使用前，将培养容器预热至室温至少1小时。
  8. 从培养容器中吸出稀释的玻连蛋白溶液并弃去。去除玻连蛋白后无需冲洗培养容器。细胞可直接在玻连蛋白包被的培养皿上传代。
    注：Geltrex 经 hESC 验证的无 LDEV 低生长因子基底膜基质可以代替玻连蛋白（参见附录）。
    表1所需的稀释玻连蛋白用量
培养容器表面积 (cm2)稀释底物的用量 (mL)
6孔板10 cm2/孔1 mL/孔
12孔板4 cm2/孔0.4 mL/孔
24孔板2 cm2/孔0.2 mL/孔
35 mm 培养皿10 cm21 mL
60 mm 培养皿20 cm22 mL
100 mm 培养皿

60 cm2

6 mL


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重编程成纤维细胞

以下实验方案已针对人新生儿包皮成纤维细胞（BJ 株；ATCC 编号 CRL2522）进行优化。我们建议您针对您的细胞类型优化实验方案。

第 -4 天至第 -2 天：接种细胞

  1. 转染前2至4天，将人成纤维细胞铺于含成纤维细胞培养基的 T75 培养瓶中。转染当天（第0天）细胞应达到约 75–90% 融合度。
    注：生长速率取决于细胞系和培养条件。根据接种密度和培养条件，细胞可能需要5天才能达到 75–90% 的融合度。
    注：由于过度融合会导致转染效率降低，因此当您的细胞在培养过程中出现过度融合时，我们推荐您重新铺板以达到 75–90% 的融合度。

    第0天：准备要转染的细胞

    注：在转染前温和处理细胞对于转染实验的成功至关重要。
  2. 每次转染时，向 15 mL 锥形管中加入 6 mL 含添加剂的成纤维细胞培养基（每次转染1管）。在 37°C 下孵育试管直至使用（见步骤23）。
  3. 从玻连蛋白包被的培养板中吸出培养基，并替换为每板 12 mL 新鲜的含添加剂的成纤维细胞培养基。将包被培养板置于 37°C 下，备用。
    注：每次转染需要使用两个 100 mm 玻连蛋白包被培养皿。
  4. 从 T75 培养瓶内的成纤维细胞中吸出用过的培养基。
  5. 使用不含钙、镁离子的 DPBS 洗涤细胞。
  6. 向每个培养瓶中加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶/EDTA。
  7. 将培养瓶在 37°C 下孵育约4分钟。
  8. 向每个培养瓶中加入 6 mL 含添加剂的成纤维细胞培养基。用手轻敲培养板，以确保细胞脱离培养板，并小心将细胞转移至空的 15 mL 锥形管中。
    注：每个 T75 培养瓶可提供大量细胞用于转染，因此胰蛋白酶/EDTA 处理后仍粘附在培养瓶上的任何残留细胞无需收集。
  9. 取 20 μL 样品进行活细胞计数，计算要执行的转染次数。每次转染需要 1 × 106 个细胞。
    转染次数 = 活细胞数/(1 × 106)
  10. 将最多可进行三次转染的足量细胞（即，1 × 106  至 3 × 106  个细胞）转移至新的 15 mL 锥形管中。
  11. 使用含添加剂的成纤维细胞培养基将新试管中的体积补足至 10 mL，并在室温下以 1,000 rpm 离心细胞5分钟。
  12. 使用玻璃巴斯德吸管小心吸出大部分上清液，留下约 100–200 μL。使用 200 μL 移液器吸去剩余的培养基。

    第0天：转染

  13. 将细胞沉淀重悬于重悬缓冲液 R（随 Neon 转染试剂盒提供）中，使最终浓度达 1.0 × 106 个细胞/0.1 mL。
  14. 将细胞（100 μL/转染反应）转移至 1.5 mL 无菌微量离心管中。
  15. 打开 Neon 装置，然后在 Input（输入）窗口中输入电穿孔参数（参见表2）。
    表2 Neon 转染系统的电穿孔参数
    脉冲电压 脉冲宽度 脉冲数 细胞密度 吸头类型
    1650 V10 ms31 × 106  个细胞/0.1 mL100 μL
  16. 向 Neon 管中加入 3 mL 电解缓冲液（对于 100 μL Neon 管吸头，使用缓冲液 E2）。
  17. 将 Neon 管插入 Neon 移液器工作站，直至听到咔嗒声。
  18. 将 8.5 μL Episomal 重编程载体转移至含有细胞的试管中，轻轻混匀。
  19. 将 Neon 吸头插入 Neon 移液器中。
  20. 按下 Neon 移液器上的按钮至第一档，并将 Neon 吸头浸入细胞-DNA 混合物中。缓慢释放移液器上的按钮，将细胞-DNA 混合物吸入 Neon 吸头。
    注：移液时避免产生气泡，以防电穿孔时产生电弧。如果在吸头中观察到气泡，则弃去样品，并再次小心地将新鲜样品吸入吸头中，不得有任何气泡。
  21. 将含有样品的 Neon 移液器垂直插入 Neon 移液器工作站中的 Neon 管中，直到听到咔嗒声。
  22. 确保您输入了适当的电穿孔参数，然后按下 Neon 触摸屏上的 Start（开始）以发出电脉冲。
    注：电脉冲发出后，触摸屏显示“Complete”（完成）表示电穿孔完成。
  23. 从 Neon 移液器工作站上取下 Neon 移液器，立即将 Neon 吸头中的样品转移到含有 6 mL 含添加剂的预热成纤维细胞培养基（在步骤2中制备）的 15 mL 试管中。
  24. 轻轻翻转混匀转染细胞，吸取 3 mL 至 100 mm 玻连蛋白包被培养板中（每次转染两块培养板）。使细胞均匀分布在培养板上。将 Neon 吸头弃置于适当的生物危害废弃物容器中。
  25. 对任何其他样品重复此过程。请勿使用 Neon 吸头超过两次。
  26. 将培养板在 37°C、加湿 CO2 培养箱中孵育过夜。

    第1天：换用含添加剂的 N2B27 培养基

  27. 用巴斯德吸管从培养板中吸出用过的含添加剂的成纤维细胞培养基。
  28. 向每块 100 mm 培养板中加入 10 mL 已添加 CHALP 分子混合物和 bFGF（使用前新鲜加入）的 N2B27 培养基。
  29. 每隔一天更换一次用过的培养基，直至转染后第15天。

    第15天：换用 Essential 8™ 培养基

  30. 吸出用过的培养基，换用 Essential 8™ 培养基。每隔一天更换一次培养基。
  31. 每隔一天在显微镜下观察培养板是否出现提示转化细胞的细胞团块（见图1）。在转染后15至21天内，iPSC 集落将生长至适于转移的大小。

图1游离重编程期间细胞的预期形态。图像显示人类新生儿包皮成纤维细胞（BJ 株）发生形态学变化并且 iPSC 集落开始出现。


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鉴定 iPSC 集落

转导后第21天，玻连蛋白包被培养板上的细胞集落大且紧密，覆盖培养容器的大部分表面积。然而，这些集落中只有一小部分由 iPSC 组成，这部分集落具有类似 hESC 的形态特征，外观类似于平坦的鹅卵石，集落中的细胞之间具有明显的界限（见图2）。因此，我们建议您使用可识别未分化 iPSC 的 Tra1-60 或 Tra1-81 抗体进行活细胞染色。

图2人新生儿包皮成纤维细胞（BJ 株）游离重编程产生的新 iPSC 的预期形态。在这些 5X 图像中，可见大量大型的巢状集落。

用抗体进行活细胞染色

选择重编程集落的最快、最可靠的方法之一是用可识别未分化 iPSC 并能够从多种人类细胞类型中鉴定出重编程细胞的 Tra1-60 或 Tra1-81 抗体进行活细胞染色。
注：也可以采用其他鉴定 iPSC 的方法（如碱性磷酸酶染色）。

  1. 从重编程培养皿中吸出培养基。
  2. 使用 KnockOut™ DMEM/F-12 洗涤细胞一次。
  3. 将稀释的一抗（小鼠抗-Tra 1-60、小鼠抗-Tra 1-81 或小鼠抗-SSEA；见“需要的材料”）加入细胞中（每 100 mm 培养皿添加 6 mL）。
  4. 将一抗和细胞在 37°C 下孵育60分钟。
  5. 从培养皿中去除一抗溶液。
    注：一抗溶液可在 4°C 条件下储存一周，最多可重复使用两次。
  6. 使用 KnockOut™ DMEM/F-12 洗涤细胞三次。
  7. 将稀释的二抗加入细胞中（每 100 mm 培养皿添加 6 mL）。
    注：可使用“需要的材料”部分列出的四种 Alexa Fluor 二抗中的任何一种。
  8. 将二抗和细胞在 37°C 下孵育60分钟。
  9. 从培养皿中去除二抗溶液。
    注：二抗溶液可在 4°C 条件下储存一周，最多可重复使用两次。
  10. 使用 KnockOut™ DMEM/F-12 洗涤细胞三次。添加新鲜的 KnockOut™ DMEM/F-12 覆盖细胞表面（每 100 mm 培养皿添加 6 mL）。
  11. 在标准荧光显微镜下观察细胞，并标记成功重编程的集落进行挑取和扩增。成功的抗体染色可极具特异性地区分重编程集落与普通转化的集落（见图3），并且可以检测长达 24–36 小时。这一点特别有用，因为它有助于在挑取前和转移到新培养皿中进行扩增后的第二天鉴定和追踪候选 iPSC 集落。

图3转染后第24天时用 Tra 1-81 抗体染色的 iPSC 集落 (10X)。

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通过 PCR 检测游离型载体

制备用于 PCR 的 iPSC

注：终点 PCR 是验证游离型载体随时间损失情况的推荐方法。

  1. 用巴斯德吸管从含 iPSC 的培养皿中吸出培养基，并用不含钙、镁离子的 Dulbecco’s PBS (DPBS) 冲洗培养皿两次。推荐用量请参见表3。
    表3所需的试剂用量
    培养容器 近似表面积 (cm2) DPBS (mL) 含 0.5 mM EDTA 的 DPBS 溶液 (mL) Essential 8™ 完全培养基 (mL)
    6孔板10 cm2/孔2 mL/孔1 mL/孔2 mL/孔
    12孔板4 cm2/孔1 mL/孔0.4 mL/孔1 mL/孔
    24孔板2 cm2/孔0.5 mL/孔0.2 mL/孔0.5 mL/孔
    35 mm 培养皿10 cm22 mL1 mL2 mL
    60 mm 培养皿20 cm24 mL2 mL4 mL
    100 mm 培养皿60 cm212 mL6 mL12 mL
  2. 向含有 iPSC 的培养皿中加入含 0.5 mM EDTA 的 DPBS 溶液。根据不同的培养皿尺寸调整 EDTA 的用量（请参见表3）。涡旋培养皿以包被整个细胞表面。
  3. 将容器在室温下孵育 5–8 分钟或在 37°C 下孵育 4–5 分钟。当细胞开始分离并变圆且在显微镜观察到集落中出现空洞时，即可从容器中取出。
    注：在更大的容器或某些细胞系中，该过程可能需要5分钟以上。
  4. 用巴斯德吸管吸出 EDTA 溶液。
  5. 根据表3向培养皿中添加预热的 Essential 8™ 完全培养基。
  6. 使用 5 mL 玻璃移液器轻轻喷射孔中的集落，取出细胞。避免产生气泡。将细胞收集到 15 mL 锥形管中。
    注：请勿从培养皿中刮取细胞。可能有明显的未脱落和遗留的细胞斑块。请勿尝试通过刮取进行回收。
    注：根据细胞系的不同，一次只能处理一到三个孔，向孔中加入 Essential 8™ 培养基后，快速取出细胞。EDTA 的初始效应将被培养基迅速中和。一些细胞系在加入培养基后会非常迅速地重新贴壁，必须一次取出1个孔的细胞。另外一些细胞系重新贴壁的速度较慢，一次可以取出3个孔的细胞。
  7. 以 200 × g 离心细胞悬液5分钟，使细胞沉淀。
  8. 吸出上清液并弃去。将细胞沉淀重悬于 500 μL DPBS 中，并将重悬细胞转移至薄壁 0.5 mL PCR 管中。
  9. 以 200 x g 离心细胞悬液5分钟，使细胞沉淀。
  10. 吸出上清液并弃去。将细胞沉淀重悬于 20 μL 重悬缓冲液中，并向重悬缓冲液中加入 2 μL 裂解液。
  11. 在培养箱或预热至 75°C 的热循环仪中孵育细胞10分钟。
  12. 短暂离心试管以收集任何凝集物。在 50 μL PCR 反应中使用 3 μL 细胞裂解液（见下文）。

    使用 AccuPrime™ 高保真 Taq DNA 聚合酶进行 PCR

  13. 按照表4所述，将以下组分添加到不含 DNase/RNase 的薄壁 PCR 管中。正向和反向引物见表5。对于多重反应，制备常见组分的预混液，以尽量减少试剂损失并实现准确移液。
    注：在不含 DNA 的环境中准备 PCR 反应。我们建议使用洁净的专用自动移液器和防气溶胶自封闭吸头。
    表4 PCR 反应的准备
    组分 每次反应用量
    10X PCR 缓冲液 II5 μL
    正向引物（10 μM 储备液）1 μL
    反向引物（10 μM 储备液）1 μL
    AccuPrime™ Taq 聚合酶（5 单位/μL）1 μL
    细胞裂解液3 μL
    无菌蒸馏水39 μL

    表5标准 PCR 引物
    转基因 引物 序列 预期大小
    oriP

    pEP4-SF1-oriP

    pEP4-SR1-oriP

    5'-TTC CAC GAG GGT AGT GAA CC-3'

    5'-TCG GGG GTG TTA GAG ACA AC-3'

    		544 bp
    EBNA-1

    pEP4-SF2-oriP

    pEP4-SR2-oriP

    5'-ATC GTC AAA GCT GCA CAC AG-3'

    5'-CCC AGG AGT CCC AGT AGT CA-3'

    		666 bp

    注：这些引物可检测全部三种游离质粒。
  14. 盖上试管，轻轻敲击混合，短暂离心收集内容物。
  15. 将试管置于热循环仪中，并使用表6中所示的PCR参数：
    表6 PCR 参数
    步骤 温度 时间 循环
    预变性94°C2分钟—
    变性94°C30秒 
    退火55°C30秒35–40
    延伸72°C1分钟 
    最终延伸72°C7分钟—
  16. 使用 2% 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。

附录

A. 用 Geltrex 经 hESC 验证的无 LDEV 基底膜基质包被培养容器

  1. 将 5 mL 瓶装 Geltrex 经 hESC 验证的无 LDEV 低生长因子基底膜基质在 2–8°C 下过夜解冻。
  2. 使用无菌冷 DMEM/F-12 按 1:1 比例稀释解冻的 Geltrex 溶液，在冰上冷却的试管中制备 1 mL 等分试样。这些等分试样可在 –20°C 下冷冻或立即使用。
    注：可根据您的需要调整按 1:1 稀释的 Geltrex 溶液的分装体积。
  3. 要制备工作储备液，在冰上使用冷 DMEM 以 1:50 的比例稀释 Geltrex 等分试样，总稀释度为 1:100。
    注：可能需要针对每个细胞系确定 Geltrex 溶液的最佳稀释度。尝试 1:30 至 1:100 的各种稀释度。
  4. 使用 Geltrex 溶液快速覆盖每个培养皿的整个表面（参见表3）。
  5. 将培养皿在 37°C、5% CO2 培养箱内孵育1小时。
    注：培养皿可立即使用或在 2–8°C 下储存最长一周。请勿使培养皿干燥。
  6. 从培养皿中吸出稀释的 Geltrex 溶液并弃去。去除后无需冲洗培养皿中的 Geltrex 溶液。现在即可将细胞直接传代至 Geltrex 基质包被培养皿上。

表7所需的 Geltrex 经 hESC 验证的基质用量

培养容器 表面积 (cm2) 稀释底物的用量 (mL)
6孔板10 cm2/孔1.5 mL/孔
12孔板4 cm2/孔750 μL/孔
24孔板2 cm2/孔350 μL/孔
35 mm 培养皿10 cm21.5 mL
60 mm 培养皿20 cm23.0 mL
100 mm 培养皿60 cm26.0 mL

B. 冻存 iPSC

  1. 在室温下预热所需用量的 Essential 8™ 培养基，直到触感不再冰凉。请勿在 37°C 水浴中预热培养基。
  2. 制备 Essential 8™ 冷冻培养基。每当需要配制 1 mL 冷冻培养基时，在无菌条件下将下列组分混合于 15 mL 无菌管内：
    组分 用量
    Essential 8™ 完全培养基0.9 mL
    二甲基亚砜 
  3. 将装有 Essential 8™ 冷冻培养基的试管置于冰上直至使用。使用后弃去剩余的冻存培养基。
  4. 使用巴斯德吸管从培养皿中吸出用过的培养基，并用不含钙、镁离子的 DPBS 冲洗细胞两次（参见表3）。
  5. 在培养皿中加入 0.5 mM EDTA 溶液。根据不同的培养皿尺寸调整 EDTA 的用量（请参见表4）。涡旋培养皿以包被整个细胞表面。
  6. 将容器在室温下孵育 5–8 分钟或在 37°C 下孵育 4–5 分钟。当细胞开始分离并变圆且在显微镜观察到集落中出现空洞时，即可从容器中取出。
  7. 用巴斯德吸管吸出 EDTA 溶液。
  8. 向6孔板的每个孔中加入 1 mL 冰冷的 Essential 8™ 冷冻培养基。
  9. 使用 5 mL 玻璃移液器轻轻喷射孔中的集落，取出细胞。避免产生气泡。将细胞收集在置于冰上的 15 mL 锥形管中。
  10. 轻轻重悬细胞。向各冻存管中分装 1 mL 细胞悬液。
  11. 将冻存管迅速置于冷冻容器（例如，Mr. Frosty）中，以每分钟降低 1°C 的速度冷冻细胞，然后将其转移至 –80°C 下过夜。
  12. 在 –80°C 下过夜储存后，将细胞转移至液氮罐气相中长期储存。

参考文献

  1. Takahashi K., and Yamanaka S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell 126 (4): 663-676.
  2. Yu, J., Chau, K. F., Vodyanik, M. A., Jiang, J., and Jiang, Y. (2011) Efficient Feeder-Free Episomal Reprogramming with Small Molecules.PLoS One 6, e17557.
  3. Nanbo, A., Sugden, A., and Sugden, B. (2007) The coupling of synthesis and partitioning of EBV’s plasmid replicon is revealed in live cells.EMBO J 26, 4252–4262.

MAN0007034          2012年8月22日

仅供研究使用。不得用于人或动物的任何治疗或诊断用途。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。