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诱导多能干细胞 (iPSC) 是一种基因重编程的成体细胞,表现出与胚胎干细胞相似的多能干细胞样状态(Meissner 等人,2007;Park 等人,2008;Takahashi 等人,2007;Takahashi 与 Yamanaka;2006;Wernig 等人,2007;Yu 等人,2007)。虽然这些人工生成的细胞在人体中并不存在,但它们表现出与胚胎干细胞 (ESC) 非常相似的特性;因此,它们是用于药物发现、细胞治疗和基础研究的多能细胞的宝贵新来源。
生成 iPSC 的方法有很多种,包括逆转录酶病毒介导的基因转导和化学诱导。逆转录病毒载体需要整合到宿主染色体中才能表达重编程基因,而基于 DNA 的载体(如腺病毒、腺相关病毒)和质粒载体以游离形式存在,不需要整合;然而,它们仍可能以一定频率整合到宿主染色体中。与这些载体不同,CytoTune® 重编程载体不会整合到宿主基因组中或改变宿主细胞的遗传信息(Fusaki 等人,2009;Li 等人,2000;Seki 等人,2010)。
CytoTune®-iPS 仙台病毒重编程系统利用基于在感受态仙台病毒 (SeV) 中进行复制的载体,安全高效地递送和表达将体细胞重编程为 iPSC 所必需的关键遗传因子。与依赖于整合到宿主细胞基因组中的病毒载体的许多可用实验方案不同,CytoTune® 重编程系统使用非整合且保留在细胞质中的载体(即,它们不占用空间)。此外,利用 SeV 的细胞质性质和引入关键病毒蛋白中的功能性温度敏感性突变,可以清除宿主细胞的载体和重编程因子基因。
CytoTune®-iPS 仙台病毒重编程试剂盒含有四种基于 SeV 的重编程载体,每种载体都能表达四种山中因子(即,Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc)中的一种,并针对从人体细胞中生成 iPSC 进行了优化。本试剂盒中的重编程载体设计用于提高生物和环境安全性。
组分 | 用量 |
---|---|
bFGF | 10 μg |
不含钙、镁离子的 DPBS | 980 μL |
10% KSR | 10 μL |
组分 | 用量 |
---|---|
DMEM | 89 mL |
经 ESC 验证的 FBS | 10 mL |
MEM 非必需氨基酸溶液,10 mM | 1 mL |
组分 | 用量 |
---|---|
KnockOut™ DMEM/F-12 | 78 mL |
KnockOut™ 血清替代物 | 20 mL |
MEM 非必需氨基酸溶液,10 mM | 1 mL |
GlutaMAX™-I 添加剂 | 1 mL |
β-巯基乙醇,1000X | 100 μL |
青霉素-链霉素(可选) | 1 mL |
bFGF (10 μg/mL)* | 40 μL |
表1.失活 MEF 的所需用量
容器尺寸 | 生长面积 | 培养基的用量 | MEF 的数量 | MEF 悬液的用量 |
---|---|---|---|---|
96孔板 | 0.32 cm2/孔 | 0.1 mL | 1.0 × 104/孔 | 4 μL |
24孔板 | 2 cm2/孔 | 0.5 mL | 5.0 × 104/孔 | 20 μL |
12孔板 | 3.8 cm2/孔 | 1 mL | 1.0 × 105/孔 | 40 μL |
6孔板 | 9.6 cm2/孔 | 2 mL | 2.5 × 105/孔 | 0.1 mL |
60 mm 培养皿 | 19.5 cm2 | 5 mL | 5.0 × 105 | 0.2 mL |
100 mm 培养皿 | 58.95 cm2 | 10 mL | 1.5 × 106 | 0.6 mL |
25 cm2 培养瓶 | 25 cm2 | 5 mL | 6.3 × 105 | 0.25 mL |
75 cm2 培养瓶 | 75 cm2 | 15 mL | 1.9 × 106 | 0.75 mL |
以下实验方案已针对人新生儿包皮成纤维细胞(BJ 株;ATCC 编号
CRL2522)进行优化。我们建议您针对您的细胞类型优化实验方案。
转导后第21天,MEF 培养皿上的细胞集落会变大且紧密,覆盖培养皿的大部分表面积。然而,这些集落中只有一小部分由 iPSC 组成,这部分集落具有类似 hESC 的形态特征,外观类似于平坦的鹅卵石,集落中的细胞之间具有明显的界限(见图1)。因此,我们建议您使用可识别未分化 hESC 的 Tra1-60 或 Tra1-81 抗体进行活细胞染色。
注:虽然最早在转导后7天就可能出现“转化”细胞的集落,但这些集落中的大多数不是正确“重编程”的细胞。iPSC 通常稍晚出现(转导后第14天左右),形态类似于胚胎干细胞,表达细胞表面标志物 Tra1-60 和 Tra1-81。
选择重编程集落的最快、最可靠的方法之一是用可识别未分化 iPSC 并能够从多种人类细胞类型中鉴定出重编程细胞的 Tra1-60 或 Tra1-81 抗体进行活细胞染色。
注:也可以采用其他鉴定 iPSC 的方法(如碱性磷酸酶染色)。1.
步骤 | 温度 | 时间 | 循环 |
---|---|---|---|
变性 | 95°C | 30秒 | 30–35 |
退火 | 55°C | 30秒 | 30–35 |
延伸 | 72°C | 30秒 | 30–35 |
表2.用于检测使用 CytoTune® 仙台病毒重编程载体重编程的细胞中 SeV 基因组和转基因的 RT-PCR 引物组
靶标 | 引物组 | 产品规格 |
---|---|---|
SeV | 正向:GGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C* 反向:ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC* | 181 bp |
Sox2 | 正向:ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC GC 反向:AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA* | 451 bp |
Klf4 | 正向:TTC CTG CAT GCC AGA GGA GCC C 反向:AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA* | 410 bp |
cMyc | 正向:TAA CTG ACT AGC AGG CTT GTC G* 反向:TCC ACA TAC AGT CCT GGA TGA TGA TG | 532 bp |
Oct3/4 | 正向:CCC GAA AGA GAA AGC GAA CCA G 反向:AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA* | 483 bp |
* 该引物包含 SeV 基因组序列。将这些引物与转基因特异性引物配对,可以特异性检测 CytoTune® 仙台病毒重编程载体携带的转基因。请注意,Sox2、Klf2 和 Oct3/4 检测使用了相同的反向引物。
问题 | 可能原因 | 解决方案 |
---|---|---|
转导后 观察到细胞毒性 | 病毒载量过高 | 降低 CytoTune® 载体量或增加起始细胞数。 |
培养板上的集落 过多 | 铺板细胞过多 | 减少转导后铺板的细胞数量。 |
无 iPSC 集落形成 | 所用的病毒量不足 |
|
与 BJ 成纤维细胞相比,iPSC 集落数太少 | 细胞类型无法有效重编程 | 并非所有细胞类型都具有相同的重编程效率。增加铺板的细胞数量。 |
iPSC 集落已分化 | iPSC 集落转移至 MEF 培养皿的时间过晚 | 更早进行染色,并将 iPSC 集落转移到新鲜的饲养层细胞中。 |
难以获得无载体 iPSC | 细胞类型不能有效消除 CytoTune® 仙台病毒重编程载体 |
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人 iPSC 培养基 | 0.5 mL |
KnockOut™ 血清替代物 | 0.5 mL |
人 iPSC 培养基 | 0.8 mL |
二甲基亚砜 | 0.2 mL |
仅供研究使用。不得用于人或动物的任何治疗或诊断用途。
MAN0006712 2012年3月22日
仅供科研使用,不可用于诊断目的。