介绍

MSC 仅占骨髓有核细胞总数的 0.01–0.0001%，需要通过体外细胞培养扩增获得足够的数量用于临床应用。MesenPRO RS 培养基是一款减血清 (2%) 培养基，专门配制用于支持人间充质干细胞 (MSC) 培养物的生长。与添加血清的传统培养基相比，MesenPRO RS 培养基有助于提高 MSC 扩增，同时保持相当的基因表达谱。使用 MesenPRO RS 培养基，MSC 能够在多次传代扩增的同时维持其多向分化潜能表型（即，分化为成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞谱系）。

在 cGMP 条件下生产的高度一致配方中将 FBS 浓度降低至 2%，有助于减小通常因经典培养基中使用的 10–20% FBS 而引入的变异性。FBS 中也有许多未知元素，比如信号转导分子、凋亡因子和营养物质。这些成分的不同浓度会引起批间差异，这意味着有些 FBS 批次不支持 MSC 培养。当用于复苏冻存 MSC 时，我们经 MSC 验证的 FBS（Ng 等人，2008；Kuçi 等人，2010）可较大限度地减少为确定最适合您应用的 FBS 批次而要检测多个 FBS 批次的需求。

与经典培养基 (DMEM + 10% FBS) 相比，MesenPRO RS 培养基（Sugii 等人，2010；Ng 等人，2008；Eibes 等人，2010；Tsigkou 等人，2010；Schraufstatter 等人，2009；Carreras 等人，2009）有助于提高 MSC 的扩增（图1），并维持三系中胚层分化潜能（图2）。

图1.与经典培养基相比，MesenPRO RS 培养基使得扩增在6天内提高 69–169%。使用标准技术从正常人骨髓单核细胞中分离出 MSC。将早期传代细胞以 3 × 103 或 5 × 103 个细胞/cm2 铺于6孔板上含 4 mM L-谷氨酰胺、5 μg/mL 庆大霉素和 10% 经 MSC 验证的 FBS 的 DMEM（低糖）培养基或含 2 mM L-谷氨酰胺和 5 μg/mL 庆大霉素的 MesenPRO RS 培养基中。在 37°C、含 5% CO2 的潮湿空气中孵育细胞，并在第3天进行补料。在第6天，使用 TrypLE 试剂收获细胞，并进行计数。数据表示两个平行孔的细胞计数平均值（通过学生 t 检验，p 值分别为 ≤ 0.007 和 ≤ 0.002）。

图2.在 MesenPRO RS 培养基中培养的人 MSC 保留了三系分化潜能。将在 MesenPRO RS 培养基中培养的人 MSC 接种到成脂、成软骨或成骨分化培养基中，培养14天，显示出 (A) 脂肪细胞（油红 O 脂质染色）、(B) 软骨细胞（阿利新蓝糖胺聚糖染色）和 (C) 成骨细胞（碱性磷酸酶染色）。

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需要的材料

  • MesenPRO RS 培养基（货号 12746-012），由 MesenPRO RS 基础培养基和 MesenPRO RS 生长添加剂组成。该培养基也以 MesenPRO RS（原产地：新西兰）试剂盒形式提供（货号 E07-1000）。(PDF)
  • L-谷氨酰胺-200mM (100X)，液体（货号25030-149、25030-164）或 CTS GlutaMAX-I 添加剂（货号 A12860-01）
  • 人 MSC (GMP)（StemPro BM 间充质干细胞）（货号 A15652）或人 ADSC（StemPro 人脂肪源性干细胞）（货号 R7788-115）
  • CTS（细胞治疗系统）DPBS，不含氯化钙，不含氯化镁（货号 A12856-01）
  • Countess 自动细胞计数仪（货号 C10227）
  • 37°C 水浴
  • 适当的组织培养容器和用品

仅用于复苏冻存的 MSC：

  • Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) [DMEM/F-12，GlutaMAX（货号10565-018、10565-042）或 DMEM（低糖，含丙酮酸盐，不含谷氨酰胺，不含酚红）（货号 11054-001）] + 10% 经 MSC 验证的胎牛血清（USDA 批准）（货号 12662-002）。经 MSC 验证的培养基也以经 MSC 验证的 FBS（澳大利亚）（500 mL，货号 12664-025）、经 MSC 验证的 FBS（新西兰）（100 mL，货号 12665-014）(PDF) 和经 MSC 验证的 FBS（新西兰）（500 mL，货号 12665-022）(PDF) 形式提供。

对于细胞传代和冻存：

  • CTS TrypLE Select 酶 （货号 A12859-01）
  • 可选：StemPro Accutase 细胞解离试剂（货号 A1110501）
  • 二甲基亚砜 (DMSO)（货号 D12345）

制备培养基与材料

用于回收和培养 MSC 的 MesenPRO RS 培养基（500 mL 完全培养基）

  1. 将 MesenPRO RS 生长添加剂在 2–8°C 下解冻过夜，解冻后立即使用。不要在 37°C 下解冻。避免反复冻融 MesenPRO RS 生长添加剂。
  2. 要制备 500 mL MesenPRO RS 完全培养基，请在无菌条件下混合下列组分：
    • MesenPRO RS 基础培养基                 485 mL
    • MesenPRO RS 生长添加剂        10 mL
    • 200 mM L-谷氨酰胺或 GlutaMAX-I          5 mL    （最终浓度 2 mM）
  3. 含添加剂的 MesenPRO RS 完全培养基可在 2–8°C 下避光储存最长2周。

 

注：在使用前，请在室温下预热当天所需的完全培养基，直到触感不再冰凉。请勿在 37°C 下预热培养基。

冻存 MSC 的复苏

注：我们建议您在解冻后将 MSC 置于 MesenPRO RS 完全培养基中复苏。*

*您可以使用传统培养基来复苏 MSC。要制备 500 mL 添加血清的 DMEM 完全培养基，在 2–8°C 下解冻经 MSC 验证的胎牛血清（USDA 批准）

  1. 在 37°C 水浴中快速解冻（<1 分钟）冷冻细胞。
  2. 使用移液管将冻存管中的全部内容物吸移到一个 50 mL 无菌锥形管中。
  3. 小心地逐滴（每10秒 2–3 滴）加入 5–7 mL 预热的 MesenPRO RS 完全培养基，同时轻轻涡旋锥形管。
  4. 再加入 5 mL 预热的 MesenPRO RS 完全培养基，同时轻轻涡旋锥形管。
  5. 将锥形管中的所有内容物转移到适当的组织培养瓶中。
  6. 在 37°C、含 5% CO2 的潮湿空气中孵育。
  7. 解冻后24小时，将用过的培养基更换为新鲜预热的 MesenPRO RS 完全培养基。
    注：对于 MSC 的复苏，建议以 ≥7 × 103 个细胞/cm2 接种细胞进行初始复苏传代。

MSC 传代

开发 MesenPRO RS 的目的是培养已经使用标准贴壁分离和生长条件（例如，DMEM + 10% FBS）开始培养的人间充质干细胞，尚未针对直接来源于初生组织的 MSC 的初始扩增进行测试。开发的 MesenPRO RS 旨在培养大于克隆密度的 MSC（见第9步）。

建议将人间充质干细胞直接传代到 MesenPRO RS 完全培养基中。传代培养前，细胞融合度必须达到 60–80%，细胞存活率至少为 90%，生长速率必须处于对数中期。

注：以下程序适用于在 T-75 培养瓶 (75 cm2) 中进行的贴壁培养。应根据所需的容器尺寸相应调整用量。

  1. 在倒置显微镜上观察培养瓶，确认细胞可供传代（60–80% 融合度）。
  2. 从融合的单层细胞中吸出培养基和漂浮细胞并弃去。
  3. 使用 5–10 mL 不含钙、镁离子或酚红的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 洗涤细胞。
  4. 去除 DPBS，向培养瓶中加入 5–7 mL 预热的 CTS TrypLE Select 酶。在 37˚C 孵育，直至细胞完全解离（约 3–5 分钟）。
  5. 采用倒置显微镜观察单层细胞，确保从培养瓶表面完全解离。
  6. 向培养瓶中加入 10 mL 预热的 MesenPRO RS 完全培养基，停止细胞解离。用移液管轻轻上下吹吸，使细胞分散成单细胞悬液。
  7. 将细胞悬液转移到无菌锥形管中。另外使用 5 mL MesenPRO RS 完全培养基洗涤培养瓶并合并到锥形管中。
  8. 以 100 × g 离心细胞悬液 5–10 分钟。
  9. 吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于适量的预热 MesenPRO RS 完全培养基中。
  10. 使用 Countess 自动细胞计数仪（可选自动或手动方法）测定总活细胞密度。
  11. 以 3–5 × 103 个活细胞/cm2 接种培养瓶，并放回培养箱内。

注：为了获得最佳性能和细胞生长，应每 3–4 天使用新鲜的完全培养基对培养物进行重新补料。

冻存 MSC

  1. 在使用当天制备 2X 冻存溶液：

    a).向 MesenPRO RS 完全培养基中加入 20% 二甲基亚砜 (DMSO)，制备 10 mL 2X 冻存溶液。使用前在 4°C 下储存。

    • MesenPRO RS 完全培养基       8 mL
    • DMSO      2 mL   （最终浓度 20%）

  2. 根据 MSC 传代的步骤 1-9，使用 MesenPRO RS 完全培养基收获细胞进行冻存。
  3. 在 0.5 mL 预热的 MesenPRO RS 完全培养基中复溶收获的细胞沉淀至预期最终细胞浓度的两倍（即，2 × 106 个细胞/mL）。
  4. 向细胞悬液中缓慢加入 0.5 mL 2X 冻存溶液，轻轻混匀，确保细胞分布均匀。
  5. 立即向预冷却 (2°C - 8°C) 的冻存管中加入所需用量的细胞悬液（即，1 mL）。
  6. 将冻存管置于 –70°C 的低温冷冻容器（例如 Mr. Frosty (1°C) 冷冻容器）中。
  7. 24小时后，将冷冻细胞转移至液氮（气相）中；建议在 –200°C 至 125°C 下储存。

参考文献

  1. Sugii S et al.(2010) Human and mouse adipose-derived cells support feeder-independent induction of pluripotent stem cells.Proc Natl Acad Sci U S A 107(8):3558–3563.
  2. Ng F et al.(2008) PDGF, TGF-beta, and FGF signaling is important for differentiation and growth of mesenchymal stem cells (MSCs): transcriptional profiling can identify markers and signaling pathways important in differentiation of MSCs into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages.Blood 112(2):295–307.
  3. Eibes G et al.(2010) Maximizing the ex vivo expansion of human mesenchymal stem cells using a microcarrier-based stirred culture system.J Biotechnol 146(4):194–197.
  4. Tsigkou O et al.(2010) Engineered vascularized bone grafts.Proc Natl Acad Sci U S A 107(8):3311–3316.
  5. Schraufstatter IU et al.(2009) C3a and C5a are chemotactic factors for human mesenchymal stem cells, which cause prolonged ERK1/2 phosphorylation.J Immunol 182(6):3827–3836.
  6. Kuçi S et al.(2010) CD271 antigen defines a subset of multipotent stromal cells with immunosuppressive and lymphohematopoietic engraftment-promoting properties.Haematologica 95(4):651–659.
  7. Carreras A et al.(2009) Obstructive apneas induce early release of mesenchymal stem cells into circulating blood.Sleep 32(1):117–119.

 

最近更新：2014年2月27日

仅供科研使用，不可用于诊断目的。