マウスジェノタイピングを迅速に行う方法–6つのPCRのヒント

従来、ゲノムDNAはジェノタイピングPCRのためにマウス組織サンプルから精製されていました。高速抽出キットを使用した場合でも、このプロセスには最低0.5～1時間かかることがあり、遠心分離機やヒートブロックなどの特別なラボ用装置が必要です。抽出試薬も必要ですが、適切な廃棄を必要とする場合もあります。

良い点は、ダイレクトPCRキットがあることです。これにより、増幅のために組織を直接PCR反応に加えることができます。特殊な装置や追加の試薬の DNA 精製や取り扱いは必要ありません（図1）。マウスの尾、マウス耳、毛のようなサンプルを卵胞で開始すると、ダイレクトPCRにより、最初から大幅な時間短縮が可能になります（図2 ）。

後で使用するためにサンプルを保存する必要があるかもしれません。実際、サンプルをDNA用に溶解し、長期保存することで、利便性が上がります（図3）。

PCRにおいて最適化は課題です。複数のプライマーセットを使用する場合、最適なアニーリング温度を見つけるのは面倒なプロセスです。また、アニーリング温度が大きく異なる場合は、同じブロックでPCR反応を実行できない可能性があります。これは、各ランの間に長い待ち時間を意味します。

幸い、ユニバーサルアニーリング機能を備えたダイレクトPCRマスターミックスがあります。つまり、さまざまなプライマーのアニーリング温度を60℃で実施できます。これにより、アニーリング温度を計算してアッセイを別々のブロックで実行する時間を大幅に節約できます。（図4）。

PCR反応にはさまざまなコンポーネント、例えばバッファー、酵素、dNTPs、MgCl₂、プライマー、およびDNAテンプレートなどが含まれます。つまり、PCR実験のセットアップには時間がかかり、ミスが発生しやすく、試薬汚染のリスクも高まります。PCRに必要なすべての成分を含むマスターミックスを使用することで、これらの課題を回避できます。プライマーと組織サンプルだけを追加する必要があります（図5）。

PCRが完了するまで長時間を待ちたくありません。幸い、PCR反応時間は、以下の3つの側面で短縮され、その影響は減少します。

1.  60秒／kbではなく15～20秒／kbでDNAを合成できるような高速PCR酵素をお探しください。
2. 高速のサーマルサイクラーを組み合わせて使用します。たとえば、高速のサイクル温度（6秒／℃など）で目的の温度まで上昇または下降させることができます。
3. 熱伝導率を向上 させるロープロファイルと、熱伝導率を向上させるための超薄壁を備えた「Fast」プラスチック（該当する場合）をお選びください。

「Fast」酵素、サーマルサイクラー、プラスチックを使用すると、1 kb以下のPCRアンプリコンをわずか40分で増幅できます（図7 ）。

従来、ローディング色素は、サンプルをゲルにロードする前に、完了したPCR反応に添加され、トラッキングと密度勾配が得られます。ごく簡単に思われるように、このプロセスには必要な容量の計算、ローディング色素の作成、PCRサンプルのピペッティング、そして最終的にそれらの混合が含まれます。これらのステップには時間がかかり、途中で発生する余分なプラスチック廃棄物は言及されません。ダイレクトPCRマスターミックスには、直接ゲルを充填するための不活性色素がすでに含まれているため、これは過去のことです（図8 ）。

PCR産物は、マウスのジェノタイプを解析するためにアガロースゲル上で日常的に泳動されます。ゲルの注入、バッファーの作成、ゲルボックスの組み立て、ゲルの染色や脱染色など、従来の電気泳動ワークフローをスキップできるとしたらどうでしょうか？サンプルをロードしてランを開始するだけでよい場合はどうすればよいですか？

幸いにも、それを行うだけの選択肢があります。ローディング、ラン、および解析の3つの簡単なステップで、マウスジェノタイピングのPCRを解析します（図9）。さらに、カメラフードが一部のシステムに統合されているため、泳動ゲルをリアルタイムで確認できます。「fast」ゲルと組み合わせることで、50 bp～2 kbのフラグメントをわずか5分で分離できます。

これらのヒントを活用することで、マウスジェノタイピングの時間を大幅に短縮し、重要な実験に集中できることを期待しています。（メリット：ラボの仲間も、ラボのサーマルサイクラーを専有しないことに感謝しているかもしれません。）