超解像顕微鏡

STORMは最も広く使用されているSRM法であり、光スイッチ可能な蛍光色素を逐次活性化し、時間分解された位置情報から高解像度なイメージを構築します。高品質なマルチカラーイメージを得るためには、直接標識、タンパク質コンジュゲート、または抗体染色を用いた特殊な標識が必要になります。STORMに最適な蛍光色素には、非常に強い蛍光強度および高速な光スイッチサイクルが求められます。また、チオールを含むバッファー中での光退色が最小限でなくてはなりません。適切な色素とバッファーを組み合わせると、最適化されたSTORMシステムでは5 nmの分解能でイメージを構築することができます。多数の公表論文で、Molecular Probes®の色素が様々なターゲティングおよび標識法と組み合わされ、マルチプレックスSTORMイメージの構築に使用されています。

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構造化照明法は空間分解能を向上させるために使用され、パターン状の光でサンプルを照明し、現れたモアレ縞に含まれている、通常の観察範囲外の情報をソフトウェアによって解析します。再構成を行うソフトウェアは、回折限界の約2倍、またはおよそ100 nmの分解能でイメージを解像します。SIMには、他のSRM法に比べて、より厚い切片、3Dイメージング、およびライブセルイメージングにも使用できるというメリットがあります。正確なターゲティングを行うと同時に明るく光安定性の高い色素を使用することで画像の品質が向上します。有機蛍光色素およびQdot®プローブとのマルチプレックス解析に加え、SIMによる生細胞観察には一般的に蛍光タンパク質が使われます。

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STED顕微鏡は2種類のレーザーパルスを用い、 各焦点スポットで蛍光の位置情報を得ます。第一のパルスは蛍光物質を励起して蛍光状態にするために使用され、第二のパルスは励起焦点スポット周辺の蛍光物質を脱励起するために使用される変形ビームです。サンプル上の焦点スポットをくまなくラスタースキャンして画像を構築するため、広い視野の場には合画像の取得スピードは比較的遅くなります。この手法の大きなメリットは、高解像度でイメージングできる被写界深度（最大で10〜15 µmの深度）が深いことです。

適切な色素を使用すれば、x軸およびy軸方向の分解能は30 nmを達成でき、z軸方向の分解能は従来の共焦点顕微鏡と同等です。STEDで最大のパフォーマンスを達成するためには、装置のシステムで使用される励起および抑制ビームの波長に合った性質を持つ蛍光色素が必要です。非常に多くの論文で、STED顕微鏡と共にMolecular Probes®の色素が用いられています。

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TPEは、多光子吸収を利用して生体試料をイメージングする光学的なプロセスであり、本手法は従来の共焦点顕微鏡に比べ光毒性が低くなっています。二光子顕微鏡は赤外励起光を使用して組織の深部まで到達し、より長い波長で励起する場合に比べ散乱が最小限に抑えられています。蛍光色素が励起するごとに二光子の赤外線が吸収され、励起は非常に小さな焦点容積に限られているため、焦点を外れた蛍光の影響が少なくなります。

二光子イメージングは、イオン濃度測定、細胞骨格形成、活性酸素検出、および小胞リサイクルなど膨大な数のライブセルアプリケーションに利用されてきました。公表論文の中でMolecular Probes®の試薬はこれら全てのアプリケーションに使用されており、プローブ選択のガイドラインとなっています。

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