Thermo Scientific™ ワンステップ IVT システムの概要

ワンステップ ヒト in vitro 翻訳キット

ワンステップ ヒト IVT キットは、ヒト細胞ライセートを使用してタンパク質を合成します。細菌（E. coli）やその他（昆虫、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球などのライセート）を用いるシステムとは異なり、ヒト細胞ライセートを使用する in vitro タンパク質発現は、機能性タンパク質を数時間以内に合成することができます。発現には、DNA または mRNA テンプレートのいずれかを用います。テンプレートは、ベクターから調製するか、弊社の遺伝子オープンリーディングフレームライブラリーから入手することができます。

in vitro タンパク質発現には、mL 反応スケールとの互換性、従来の細胞ベース手法と比べて迅速（細菌の培養には一晩、バキュロウイルスタンパク質の調製には数週間を要する）などの利点があります。このスモールスケールな発現手法により、多数の突然変異体をマイクロプレートで同時に発現させること、または将来的に個々のタンパク質を大量に発現させることが容易になります。また、スモールスケールな合成は、細菌発現システムにおいて典型的な問題である封入体へのタンパク質凝集を回避するためにも有用です。さらに、in vitro でのタンパク質発現であれば、生細胞内では不可能な毒性タンパク質の発現も可能です。タンパク質発現システムは、あらゆる種のタンパク質を発現することが可能であり、原核生物および真核生物の双方からもたらされた多数の遺伝子について妥当性確認が行われています。

特長：

• 機能的 – ヒトの翻訳機構を利用して、活性タンパク質を発現します
• 簡便 – 転写と翻訳をワンステップで行います
• ハイパフォーマンス – ウサギ網状赤血球 in vitro 翻訳より高収量です
• 確実 – ウサギ網状赤血球システムでは崩壊してしまうタンパク質でも、発現させることができます

従来法よりも優秀な点：

• HeLa 無細胞抽出液は、翻訳後修飾を受けたタンパク質を発現させることができます
• 正確な翻訳によって、その後の用途に見合った完全なタンパク質が合成されます
• タンパク質の翻訳は、EMCV IRES など mRNA 安定化因子で最適化されます

酵素活性およびタンパク質相互作用に対するタンパク質機能アッセイには、障害となりうる問題がいくつかあります。例えば、好適な抗体が存在しないと、共免疫沈降およびゲルスーパーシフトアッセイによる複雑な試料のタンパク質同定、検証ができないことがあります。また、発現レベルが低いと、標的タンパク質の濃縮性能に悪い影響を与え、特定のアッセイに必要な収量を得られない場合があります。このような問題は、in vitro 発現タンパク質を使用することで解決できる可能性があります。しかしながら、多くの無細胞タンパク質発現システムは、機能性タンパク質を高レベルで合成する能力がないか、十分な確実性を有していません。こうした問題は、真核生物のタンパク質で、適切な翻訳後修飾が重大な意味を持つ場合には、より一層深刻です。

タンパク質相互作用とヒト IVT システム

あるタンパク質の機能を理解するために、他の生体分子（DNA、RNA、他のタンパク質など）とどのように相互作用しているかを分析しなければならないことがよくあります。タンパク質と核酸（DNA または RNA）の相互作用は、ゲルシフトアッセイ（EMSA）によってモニタリングすることができ、アポトーシスを再現することでその機構の制御方法を解明するために有用です。タンパク質間の相互作用は、共免疫沈降およびプルダウンアッセイで分析することができ、新たな結合パートナーを同定するために役立ちます。

in vitro 翻訳タンパク質をタンパク質相互作用アッセイに用いると、生細胞からタンパク質を抽出する必要がなくなるとともに、多様なアイソタイプまたは変異体のタンパク質を迅速かつ効率的にスクリーニングする性能を高めてくれます。以下は、ヒト IVT システムで合成された組換えタンパク質を使用したタンパク質相互作用アッセイの事例です。

In vitro 翻訳反応は、ハイスループットな変異体解析または低分子スクリーニングで使用するタンパク質の合成に最適です。こういったアッセイは、マルチウェルプレートで分析するため、通常、ナノグラム量からマイクログラム量の濃縮されたタンパク質を必要とします。ヒト IVT システムの反応系は、1 mL あたりの相対収量を低下させることなく、96 ウェルプレート（反応容量は標準で 25 µL）および 384 ウェルプレート（反応容量は 10 µL）にスケールダウンすることができます。このような特徴によって、PCR を介した変異体解析を行うこと（PCR の手順を参照）、in vitro 翻訳で合成された変異体タンパク質のライブラリーを、マイクロプレートで直接、迅速にスクリーニングすることが可能です。

低分子スクリーニングでは、個々のタンパク質を複数のウェルで in vitro 翻訳によって発現させ、別々の低分子の探索に使用することができます。これについては、既知のタンパク質翻訳阻害剤を使用した事例を以下にご紹介いたします。

事例：カスパーゼ 3 の発現および機能

従来の in vitro 翻訳システムは、細菌や昆虫など哺乳動物以外の無細胞抽出液に基づいているため、合成可能なタンパク質の種類に制限があり、異所的な成分の添加を必要とします。ヒト IVT システムは、タンパク質合成および適切な翻訳後修飾に必要な酵素を内在的に含む、ヒト HeLa 細胞抽出液を使用しています。そのため、ヒト IVT キットで多くの種類のタンパク質を発現させることができます。

広範な分子量のタンパク質発現

良好なタンパク質の発現には、タンパク質の安定性、折りたたみ、および溶解性が影響します。分子量が大きなタンパク質は、小さなタンパク質と比較して、翻訳中止となる可能性がより高く、三次構造がより複雑で不適切な折りたたみが起こる危険性が増えるため、in vitro で発現させるのは困難です。加えて、大きなサイズのタンパク質は大きな疎水性領域を持っており、E. coli 抽出液で発現させた場合、封入体の形成を助長する可能性があります。ワンステップ ヒト in vitro 翻訳システムは、広範なサイズのタンパク質合成に使用することができます。

リン酸化タンパク質の発現

ワンステップ ヒト IVT システムは、HeLa 細胞ライセートを使用して無細胞タンパク質発現を行います。ヒト細胞を用いたシステムで合成されるタンパク質は、翻訳後修飾も含め自然なものの複製であり、自然のタンパク質が持つ機能および構造を示します。あるタンパク質がヒト IVT システムで発現したことは、ウェスタンブロットによるキナーゼ検出で実証できますが、すべてのタンパク質を検出しても、そのタンパク質の機能性を実証できるとは限りません。そこで、3 つのキナーゼ（オーロラ A、ERK1、Akt）について、その機能性を示すリン酸化状態を、リン酸化特異的抗体を用いたウェスタンブロットで合わせて確認しました。 in vitro 翻訳 Akt のリン酸化状態は、血小板由来成長因子（PDGF）で活性化された NIH3T3 線維芽細胞内の リン酸化状態と同一のサイズでした。このことは、ヒト IVT システムが、in vivo と同様の機能的なキナーゼを合成できることを示唆しています。

糖タンパク質の発現

ウサギ網状赤血球ライセートを使用する方法は、最も普及しているin vitro発現手法です［3］。この方法では、5' キャップ構造に依存しない発現、および N 結合型グリコシル化のような初期のタンパク質翻訳後修飾を引き起こすことが可能です。ただし、このような翻訳後修飾のためには、イヌ由来ミクロソームメンブレン（細胞破砕後に形成される小胞体（ER）の小胞状残渣）の添加が必要になります（4）。ウサギ網状赤血球ライセートにミクロソームメンブレンを添加することで、糖タンパク質の合成が可能になりますが、この手法を用いるとタンパク質全体の収量が大幅に減少してしまいます。

ワンステップ ヒト 結合型 IVT キットの場合、標準手順を適応することで、N 結合型糖タンパク質の発現に最適化できます。

膜タンパク質の発現

膜タンパク質では、その疎水性の膜貫通領域によって、 in vitro 翻訳タンパク質の多くに凝集および沈降が起こることがあるため、精製が極めて困難です。しかし、ヒト in vitro 翻訳システムは、無数の多様な膜貫通領域を持った膜タンパク質（グリコフォリン GypB/E、ミトコンドリア外膜タンパク質 Bcl2 のファミリータンパク質 Bcl2L1、ケモカインレセプター CXCR4 など）であっても合成することができます。さらに、すべてではなくても、大部分のタンパク質が沈殿物ではなく可溶性画分にあるということは、膜タンパク質が、溶液中で凝集も沈降も起こさず合成されたことを明示しています。

アミノ酸をより緩やかな割合で添加すること、および膜成分に富んだ HeLa 抽出液をワンステップ ヒト in vitro 翻訳システムに用いることは、膜タンパク質の折りたたみおよび溶解性を強めると考えられます。加えて、マイクログラム量スケールのタンパク質発現レベルでは、凝集（細菌を用いた発現では、よく問題となります）の原因となる閾値を超えた初期タンパク質の濃縮は起こらないと考えられます。E. coli 抽出液を用いるシステムでは、通常、アミノ酸をより急激な割合で添加し、タンパク質の収量もより多くなりますが、折りたたみの効率が下がることで、膜の濃度が低くなり、タンパク質の凝集が起こる可能性は高くなります［6、7］。同じように、in vivo での発現手法では、膜タンパク質をミリグラム量スケールで合成することができますが、封入体の形成が頻繁に起こります。封入体はタンパク質の凝集物であり、これを解離させて可溶性のタンパク質にするには、極めて時間が掛かり困難を要します。

同一反応液内における複数のタンパク質の共発現

異なるタンパク質の共発現は、変異体解析や低分子の取り扱いにおいて、結合親和性の変化を評価するために行われており、ワンステップ ヒト IVT システムでも 1 回の翻訳反応で複数のタンパク質を共発現させることが可能です。ヒト in vitro 翻訳システムの 1 回の反応で、実際に、5 つもの HA タグ付きタンパク質を発現させることができました。