Illuminaシステム上のmRNA-seq用Collibriライブラリ調製キット

* 以前は、ribo-depleted RNAを使用して、ヒト、マウス、ラット以外のサンプルの全トランスクリプトームシーケンシングを行うこともできました。
** Collibri Stranded RNA Library Prep Kitには含まれません。別売り。

Dynabeads mRNA Direct精製キット（別売り）には、さまざまなサンプルからmRNAトランスクリプトームを単離するための磁気ビーズが含まれています。溶解／結合緩衝液中のRNase阻害剤と厳密なハイブリダイゼーションおよび洗浄ステップを組み合わせることで、インタクトなmRNAの単離が可能です。リボソームRNAおよび小RNA分子（トランスファーRNA、microRNA、核小体低分子RNA、および細胞質低分子RNA）はビーズに結合せず、調製から除去されます。ポリアデニル化RNA種（mRNA）のみが取り込まれるため、よりクリーンな調製と感度の高い結果を得られます。数分以内に純粋なmRNAを単離し、下流アプリケーションですぐに使用できます。

Collibri Stranded RNA Library Prep Kitは、SuperScript IV Reverse transcriptase、Dynabeads磁気ビーズ、Collibri Library Amplification Master Mixの優れた機能を組み合わせています。このマスターミックスにはPlatinum SuperFi DNA Polymeaseが含まれており、各サンプルの複雑さを明らかにする高品質なシーケンシングに対応したNGSライブラリを調製します。

rRNAの除去／mRNAの濃縮と断片化に続いて、RNAサンプルはヘルパーアダプターミックスにハイブリダイズします。このアダプターミックスは、一方の末端に1本鎖の変性配列を、もう一方の末端には定義済みの配列を持つRNA／DNAオリゴヌクレオチドのセットですハイブリダイズしたアダプターはRNAにライゲーションされ、SuperScript IV酵素Mixを使用して逆転写されcDNAが生成されます。ライブラリ増幅ステップでは、Platinum SuperFi Library Amplification Mastermixを使用してi7インデックスを導入し、シングルリードまたはペアエンドシーケンシングに対応したシーケンシング対応ライブラリを生成します。

Collibri Library Quantification Kitは、シーケンシング前のライブラリのqPCRベースの定量に推奨されます。

最高の成功率が得られるように、正しい混合を行った場合にのみ各ステップで追跡用色素が変化します。色素変化が生じない場合には、いったん中断し、完全に混合してから続ける必要があります。ビジュアルフィードバックはロボットシステムの性能をモニタリングするために有用です。

サンプルのリクエスト

RNA-seq発現データのばらつきは、出発材料の質や実験者などのさまざまな因子に起因する場合があります。米国国立標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology；NIST）が設けた学術、施設、および公共機関の特別グループである外部RNAコントロールコンソーシアム（External RNA Controls Consortium；ERCC）は、これらの因子によるばらつきと真の遺伝子発現を区別する外部RNAコントロールの共通セットを開発しました。コントロールは、定義されたパフォーマンス基準に対して測定するために、サンプル単離後にRNAシーケンシング実験に追加するようデザインされた非標識ポリアデニル化転写物で構成されています。当社のERCC Spike-In Mixesは、NIST認定DNAプラスミド由来の追跡可能な92の転写物の調製済みブレンドです。この転写物は、250～2,000 nt長の天然真核性mRNAを模倣します。ERCCコントロールをRNAシーケンシング実験に含めることで、遺伝子発現実験間のデータ比較のための標準測定を確立でき、実験の感度（検出下限）およびダイナミックレンジの測定を可能にします。

ヒント：ERCC RNA Spike-In MixesをFFPE RNAなどの分解が進んだサンプルとともに使用しないでください。高品質ERCC RNAはこれより低品質なRNA集団を大きく上回ってしまい、最終ライブラリでERCC RNAが占める比率が大きくなりすぎることになります。