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活细胞成像了解染色活细胞进行动态成像实验的简单步骤。 |
活细胞的荧光成像用于观察动态细胞过程并随时间追踪细胞生物分子和结构。活细胞荧光成像用于观察动态细胞过程并随时间跟踪细胞生物分子和结构。 活细胞荧光成像能够分析天然状态的细胞,从而保留细胞功能,能够研究细胞骨架重排、细胞凋亡、细胞迁移、内吞作用、吞噬作用和细胞器动力学等细胞过程,是药物发现、癌症、发育生物学、环境科学和其他医学领域研究的利器。
使用如下指南设计活细胞成像实验、选择试剂,轻松拿到可靠的数据。
活细胞成像试剂包括靶向性荧光蛋白和膜渗透荧光染料。许多活细胞成像试剂可用于数小时或数天的延时成像,也有一些试剂适合终点检测、细胞染色后立即成像和分析。 染色浓度、孵育时间、成像时间和间隔/频率应根据经验确定,以尽量减少细胞毒性并保留细胞功能。
下面的活细胞成像指南中的试剂与自动化高内涵和基于培养箱的荧光成像系统兼容,例如:配备 EVOS Onstage 培养箱的 Thermo Fisher Scientific 的 EVOS M7000 和 M5000 细胞成像系统、CellInsight HCS 高内涵平台、PerkinElmer 的 MuviCyte™ 活细胞成像系统*、Leica 的 Thunder 和 Mica* 以及 Sartorius 的 Incucyte® 活细胞分析系统™*。
细胞凋亡是一种严格控制的程序性细胞死亡过程,用于去除多余的、受损的和不需要的细胞或组织。 细胞凋亡可以通过 caspase 激活、DNA 片段化、线粒体活性破坏和质膜变化来检测。 CellEvent Caspase 3/7 试剂是荧光型 caspase 底物,可检测 caspase 激活以测定活细胞的细胞凋亡。 这些试剂不需要洗涤步骤,可用于 48 小时或更长时间的实时和延时活细胞凋亡成像。
图 1.使用 CellEvent 半胱天冬酶-3/7 绿色荧光测定试剂(货 CellEvent Caspase-3/7 Green 试剂(货号 C10432)检测细胞凋亡的工作流程。将待测细胞铺到孔板内,然后加入稀释的 CellEvent Caspase-3/7 Green 检测试剂。 CellEvent Caspase 3/7 染料可直接在完全培养基中使用,无需清洗。 最快可在试剂加入30分钟后开始检测荧光,最长可达 72 小时。
图 2.使用 CellEvent Caspase 3/7 Green 染色检测细胞凋亡的示例。HuVEC 细胞用 CellEvent Caspase 3/7 Green Assay(货号 C10432)染色处理,并在处理后 0、24、48 和 72 小时使用 Incucyte® ZOOM 活细胞分析系统成像。 (图像来源:Sambi M, Samuel V, Qorri B, Haq S, Burov SV, Markvicheva E, Harless W, Szewczuk MR.A Triple Combination of Metformin, Acetylsalicylic Acid, and Oseltamivir Phosphate Impacts Tumour Spheroid Viability and Upends Chemoresistance in Triple-Negative Breast Cancer.Drug Des Devel Ther.2020;14:1995-2019 PMID: 32546966)
活细胞成像试剂包括用于识别细胞成分的细胞结构试剂和用于分析细胞功能和过程的细胞功能试剂。 例如,MitoTracker 染料在活细胞的活性线粒体中积累,并共价附着在线粒体上,以评估线粒体定位和丰度。 相比之下,TMRM 和 TMRE 是动态线粒体膜电位指示染料,它们会根据膜电位在线粒体内外流动。
图 3.监测活细胞中的活性线粒体。培养患者的成纤维细胞系,并用 MitoTracker Red (货号 M22426)、Image-iT DEAD Green 染料 (货号 I10291)、Hoechst(货号 R37165)进行活细胞染色, 并在 Incucyte® ZOOM 活细胞成像系统上检测和分析。(图像来源:Smith GA, Jansson J, Rocha EM, Osborn T, Hllett PJ, Isacson O. Fibroblast Biomarkers of Sporadic Parkinson's Disease and LRRK2 Kinase Inhibition.Mol Neurobiol.2016 Oct;53(8):5161-77.PMCID: PMC5012155.)用 MitoTracker Red 染色的细胞如图所示,线粒体活跃的细胞呈鲜红色,死亡细胞呈绿色,细胞核呈蓝色,并用 Incucyte® ZOOM 活细胞分析仪进行成像。
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在各种实验操作、标记检测和成像观察过程中一直保持细胞存活和健康并非易事。对于延时成像和细胞长时间暴露于周围环境条件下的实验,培养基的选择尤为重要。若要获得可靠的活细胞成像实验结果,非常重要的一点是:细胞必须健康并保持存在尽可能接近生理温度、pH、氧气水平及其他条件的环境中。
这些培养基和洗涤缓冲液专门用于活细胞成像和检测。在实验中使用它们可以帮助您提高图像清晰度、减少背景荧光并提高细胞活力。
小贴士通过使用专门为活细胞成像和检测而开发的培养基和洗涤缓冲液,您可以提高图像清晰度、减少背景荧光并提高细胞活力。查阅产品选择指南 |
应选用合适的荧光染料(特异性靶向的荧光蛋白或小的膜通透性试剂)来检测目标细胞的结构或过程。可以使用其他荧光染料一起同时检测多个细胞结构和过程,但需要使用 SpectraViewer 荧光光谱查看器检查激发光谱和发射光谱以确保不同荧光染料之间符合最小光谱重叠。切记尽量避免使用过多的荧光标记,因为过多的荧光标记会导致:
小贴士
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通过使用减少细胞外荧光并能增加荧光染料光稳定性的试剂,可以最大程度的优化信噪比。在专门设计用于维持细胞健康同时减少或消除活细胞成像实验中的背景荧光的培养基中成像非常重要(请参见表 1)。加入适用于活细胞的背景抑制剂也有助于减少细胞外背景荧光,并且不需要额外清洗步骤。可以将活细胞抗淬灭试剂用于样品,以减少荧光染料的光漂白,从而防止多次或长时间曝光导致信号丢失。
表 1.成像培养基比较。
试剂 | 细胞清洗 | 短时成像 | 持续成像 4 小时 | 长时成像 |
---|---|---|---|---|
Gibco PBS, pH 7.4 | ||||
Gibco FluroBrite DMEM |
小贴士
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为了使光毒性最小,推荐选择可以最大程度地控制光源的成像系统。尝试使用尽可能低的光强度、曝光时间、波长范围和激发能量来照亮激发细胞,同时维持低背景下的良好信号。使用能够以最低的荧光染料激发水平提供最高信号的光照。在某些情况下(特别是当您希望长时间成像时),建议使用较短的曝光时间或较低的放大倍数,牺牲分辨率来获得更健康的细胞。
较长时间的活细胞成像可能非常具有挑战性,因为观察目标可能会在实验过程中因移动而失焦。许多显微镜具有自动聚焦功能,可以帮助您保持更长的目标聚焦时间并减少焦点漂移。另外,将细胞培养在恒定温度并保持容器中溶液的体积恒定也有助于解决聚焦漂移问题。
许多细胞比较敏感,不能允许偏离它们的最佳温度、摩尔渗透压浓度、pH 和湿度。具体要求因您所关注的实验性问题而有所不同。例如,研究细胞生长和分裂的实验与涉及受体激活和钙积累的实验相比可能有不同的要求。一些强健的永生细胞系可以允许短时期的成像或监测,而无需任何环境控制。相反,对于长期成像和检测研究,永生细胞和原代细胞的良好结果通常需要严格控制环境参数。
在加入了 Invitrogen CellTracker Deep Red 染料的 HDFn 细胞培养物中的划痕实验。(A) 对照射区域重复照射 10 小时。该区域中的细胞呈现出光毒性迹象(细胞活力丧失,因细胞无法生长到划痕处)。(B) 对比未照明区域中的细胞发现,有活力的细胞可以生长至划痕上。
上面的细胞显示出由于过度曝光导致的细胞膜灾难性起泡。起泡是用于描述由毒性引起的膜扰动的术语。相比之下,下面的细胞相对更健康,并且没有显示出异常形态。
为避免用不健康细胞进行下一步实验的麻烦,当与多种荧光试剂结合使用以检测细胞活力、细胞凋亡、细胞毒性和转染效率时,可以先在Countess III FL 自动细胞计数仪上进行细胞健康的快速检查。可重复使用的载玻片选项可降低消耗成本。
Invitrogen EVOS 台式培养室是专门为 Invitrogen EVOS 成像系统设计的一个环境控制设备,可以精确控制温度、湿度和三种气体调节,以便在生理和非生理条件下对活细胞进行延时成像。
用于 Thermo Scientific CellInsight HCA 平台的 Invitrogen HCA台式培养器可精确控制温度、湿度和 CO2 水平,这样就可以观察和测量生物活性及其随时间的变化。从长时成像研究中收集的数据是定量分析研究的基础,尤其是与 Thermo Scientific HCS Studio 软件结合使用以提高统计能力时更是如此。
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如您立即需要选品支持,可通过1. 点击页面右下角人工客服咨询;2. 拨打400 820 8982-2-7 两种方式获得支持。
在各种实验操作、标记检测和成像观察过程中一直保持细胞存活和健康并非易事。对于延时成像和细胞长时间暴露于周围环境条件下的实验,培养基的选择尤为重要。若要获得可靠的活细胞成像实验结果,非常重要的一点是:细胞必须健康并保持存在尽可能接近生理温度、pH、氧气水平及其他条件的环境中。
这些培养基和洗涤缓冲液专门用于活细胞成像和检测。在实验中使用它们可以帮助您提高图像清晰度、减少背景荧光并提高细胞活力。
小贴士通过使用专门为活细胞成像和检测而开发的培养基和洗涤缓冲液,您可以提高图像清晰度、减少背景荧光并提高细胞活力。查阅产品选择指南 |
应选用合适的荧光染料(特异性靶向的荧光蛋白或小的膜通透性试剂)来检测目标细胞的结构或过程。可以使用其他荧光染料一起同时检测多个细胞结构和过程,但需要使用 SpectraViewer 荧光光谱查看器检查激发光谱和发射光谱以确保不同荧光染料之间符合最小光谱重叠。切记尽量避免使用过多的荧光标记,因为过多的荧光标记会导致:
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通过使用减少细胞外荧光并能增加荧光染料光稳定性的试剂,可以最大程度的优化信噪比。在专门设计用于维持细胞健康同时减少或消除活细胞成像实验中的背景荧光的培养基中成像非常重要(请参见表 1)。加入适用于活细胞的背景抑制剂也有助于减少细胞外背景荧光,并且不需要额外清洗步骤。可以将活细胞抗淬灭试剂用于样品,以减少荧光染料的光漂白,从而防止多次或长时间曝光导致信号丢失。
表 1.成像培养基比较。
试剂 | 细胞清洗 | 短时成像 | 持续成像 4 小时 | 长时成像 |
---|---|---|---|---|
Gibco PBS, pH 7.4 | ||||
Gibco FluroBrite DMEM |
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为了使光毒性最小,推荐选择可以最大程度地控制光源的成像系统。尝试使用尽可能低的光强度、曝光时间、波长范围和激发能量来照亮激发细胞,同时维持低背景下的良好信号。使用能够以最低的荧光染料激发水平提供最高信号的光照。在某些情况下(特别是当您希望长时间成像时),建议使用较短的曝光时间或较低的放大倍数,牺牲分辨率来获得更健康的细胞。
较长时间的活细胞成像可能非常具有挑战性,因为观察目标可能会在实验过程中因移动而失焦。许多显微镜具有自动聚焦功能,可以帮助您保持更长的目标聚焦时间并减少焦点漂移。另外,将细胞培养在恒定温度并保持容器中溶液的体积恒定也有助于解决聚焦漂移问题。
许多细胞比较敏感,不能允许偏离它们的最佳温度、摩尔渗透压浓度、pH 和湿度。具体要求因您所关注的实验性问题而有所不同。例如,研究细胞生长和分裂的实验与涉及受体激活和钙积累的实验相比可能有不同的要求。一些强健的永生细胞系可以允许短时期的成像或监测,而无需任何环境控制。相反,对于长期成像和检测研究,永生细胞和原代细胞的良好结果通常需要严格控制环境参数。
在加入了 Invitrogen CellTracker Deep Red 染料的 HDFn 细胞培养物中的划痕实验。(A) 对照射区域重复照射 10 小时。该区域中的细胞呈现出光毒性迹象(细胞活力丧失,因细胞无法生长到划痕处)。(B) 对比未照明区域中的细胞发现,有活力的细胞可以生长至划痕上。
上面的细胞显示出由于过度曝光导致的细胞膜灾难性起泡。起泡是用于描述由毒性引起的膜扰动的术语。相比之下,下面的细胞相对更健康,并且没有显示出异常形态。
为避免用不健康细胞进行下一步实验的麻烦,当与多种荧光试剂结合使用以检测细胞活力、细胞凋亡、细胞毒性和转染效率时,可以先在Countess III FL 自动细胞计数仪上进行细胞健康的快速检查。可重复使用的载玻片选项可降低消耗成本。
Invitrogen EVOS 台式培养室是专门为 Invitrogen EVOS 成像系统设计的一个环境控制设备,可以精确控制温度、湿度和三种气体调节,以便在生理和非生理条件下对活细胞进行延时成像。
用于 Thermo Scientific CellInsight HCA 平台的 Invitrogen HCA台式培养器可精确控制温度、湿度和 CO2 水平,这样就可以观察和测量生物活性及其随时间的变化。从长时成像研究中收集的数据是定量分析研究的基础,尤其是与 Thermo Scientific HCS Studio 软件结合使用以提高统计能力时更是如此。
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用 50 mM 甲萘醌处理的 U2OS 细胞。四甲基罗丹明,甲酯,高氯酸盐 (TMRM)(货号 T668)线粒体电位指示剂,并随着氧化应激而褪色,如 CellROX Green 试剂(货号 C10444)所示。
用 Tubulin Tracker Deep Red(货号 T34076)标记的海马神经元。
海报:用于活细胞显微镜检查中半胱天冬酶活化和线粒体超氧化物的新一代传感器
海报:使用酶标仪对 2D 和 3D 细胞模型进行细胞健康状况评估
海报:使用荧光显微镜和高内涵成像技术对活细胞和固定细胞进行低氧测量
海报:通过荧光表征评估细胞衰老
*Incucyte® Live-Cell Analysis System 是 Essen BioScience 的商标或注册商标。除非另有说明,Incucyte、Essen BioScience 及所有 Essen BioScience 产品名称均为 Essen BioScience 的注册商标和财产。Essen BioScience 是 Sartorius 的子公司。MuviCyte™ live-cell imaging system 是 PerkinElmer 的商标或注册商标。THUNDER Imager Live Cell & 3D Assay 和 MICA Microhub 显微镜由 Leica Microsystems CMS GmbH 销售。
仅供科研使用,不可用于诊断目的。