细胞培养维持指导原则

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什么是传代？

传代即去除原培养基并将细胞从原培养体系转移到新鲜的生长培养基中，该过程可使细胞系或细胞株进一步增殖。

培养细胞增长模式的特征

接种后培养细胞的生长将从 延滞期进入 对数期，即细胞呈指数增殖。当贴壁培养的细胞已占据所有可用基质、没有扩增空间，或者悬浮培养的细胞已超过培养基所能支撑的能力，无法进一步生长时，细胞增殖速度将大大降低甚至完全停止 (参见下方的图4.1)。为了将细胞密度维持在最佳水平，以便细胞继续生长，并且刺激其进一步增殖，必须将培养物分成若干部分，并添加新鲜培养基。

图4.1： 培养细胞增长模式的特征。半对数图形显示了细胞培养密度对培养时间的关系。培养基中的细胞通常以标准生长模式增殖。细胞接种后第一个生长阶段是延滞期，此阶段细胞生长缓慢，处于适应培养环境、为快速生长做准备的状态。延滞期之后是对数期，此阶段细胞呈指数增殖，消耗生长培养基中的营养素。当所有生长培养基均被耗尽 (即：一种或多种营养素耗竭) 或者细胞已占据所有可用基质时，细胞即进入静止期 (即：平台期)，其增殖速度大大降低甚至完全停止。

何时时行继代培养？

对于贴壁培养和悬浮培养而言，判断是否需要传代的标准大致相同；但是，哺乳动物和昆虫细胞系之间存在一些差异。

细胞密度

哺乳动物细胞： 贴壁培养的细胞应该处于到达汇合点之前的对数传代阶段。正常细胞达到汇合状态时会停止生长 (接触抑制)，重新接种后需要较长时间才能恢复。转化细胞即使达到汇合状态也能继续增殖，但是在经过大约两个倍增时间后通常会变质。类似地，悬浮培养的细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时也应进行传代。达到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。

昆虫细胞： 昆虫细胞在处在到达汇合点前的对数期亚传代阶段。牢固贴壁的昆虫细胞达到汇合状态时也可传代，虽然此时细胞更容易从培养容器上解离下来，但是如果反复将昆虫细胞在密度超过汇合的状态下传代，细胞的倍增次数会减少，活力会降低，贴壁能力也会下降。另一方面，将贴壁培养的昆虫细胞在达到汇合状态前传代需要较大的机械力，才能使细胞从单细胞层中脱离。反复在达到汇合状态前传代，会导致细胞倍增次数减少，活力降低，健康度较差。

培养基耗尽

哺乳动物细胞： 生长培养基pH值降低通常表示乳酸蓄积，乳酸是细胞代谢的副产物。乳酸对细胞有毒性，低pH值对细胞培养并不是值得推荐的办法。 pH值改变的速度通常取决于培养体系中的细胞浓度，细胞浓度越高，培养基耗竭的速度越快。如果发现pH值迅速降低 (>0.1 – 0.2 pH单位)，同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。

昆虫细胞： 用于昆虫细胞培养的生长培养基通常比哺乳动物细胞培养基酸度大。例如，用于Sf9细胞培养的TNM-FH和Grace培养基的pH值为6.2。与哺乳动物细胞培养过程不同，昆虫细胞生长时培养基的pH值会逐渐升高，但一般不会超过6.4。但是，与哺乳动物细胞一样，昆虫细胞达到较高密度后生长培养基的pH值也会开始降低。

继代培养时间表

严格按照预定时间进行细胞传代可确保细胞的生物学行为稳定，便于监测其健康状态。从某一接种密度开始逐渐调整细胞接种密度，直到达到适合该细胞的稳定生长速度和产量。细胞偏离如此确定的生长模式通常表示细胞健康状况不佳 (例如：变质、污染) 或者培养体系的某一组分功能异常 (例如：未达到最佳温度，培养基过于陈旧)。我们强烈建议您保留详细的 细胞培养记录，记录加料和传代时间、所用培养基种类、解离方法、分种率、形态学观察结果、接种浓度、产量和抗生素用法。

最好按照传代时间安排开展实验和其它非常规操作 (如更换培养基种类)。如果您的实验安排与常规传代时间安排不吻合，则应确保当细胞仍处于延滞期或者已经达到汇合状态、停止生长时，不进行传代。

游离贴壁细胞

贴壁细胞传代的第一步是通过酶或机械方法将细胞从培养容器表面解离下来。下表列出了各种细胞解离程序。

程序	解离剂	应用
摆脱	轻轻震动或者摇动培养皿，或者用移液器充分搅拌。	松散贴壁的细胞, 有丝分裂的细胞
刮	细胞刮器	对蛋白酶敏感的细胞株；可能损伤部分细胞
酶解	Trypsin	超强贴壁细胞
酶分解	胰蛋白酶+胶原酶	高密度培养时，培养层形成多层的结构，尤其是成纤维细胞
酶分解	Dispase	使形成完整、汇合片层的表皮细胞从培养皿表面脱离下来，而不将细胞解离
酶分解	TrypLE™分解酶	强贴壁性细胞；直接替代胰蛋白酶；需要使用非动物源性试剂的领域

TrypLE™解离酶

TrypLE™ Express和TrypLE™ Select 是利用微生物生产的细胞解离酶，其动力学性质和裂解特异性均与胰蛋白酶类似。虽然TrypLE™酶可直接替代胰蛋白酶用于细胞解离操作，无需更改实验流程，但是我们建议您开始时应优化解离的孵育时间。由于TrypLE™酶是一种重组真菌胰蛋白酶样蛋白酶，因此适用于需要使用非动物源性试剂的领域。下表将 TrypLE™ Express和TrypLE™ Select与胰蛋白酶进行了比较。

TrypLE™表达和TrypLE™选择	Trypsin
完全非动物和人类来源的衍生组分	猪源性或牛源性
在室温条件下稳定保存六个月以上	在室温下不稳定
不需要灭活	需要用血清或其他抑制剂灭活